[發(fā)明專利]一種重組食甲基丁酸桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110389433.0
• 申請日: 2021-04-12
• 公開（公告）號: CN113106047A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳可泉;秦家倫;王昕;王雪麟;馬琛
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12P7/52;C12R1/145
• 代理公司: 南京擎天知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32465
• 代理人: 涂春春

本發(fā)明公開了一種重組食甲基丁酸桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。以食甲基丁酸桿菌為來源，構(gòu)建過表達甲醇利用和丁酸合成基因工程菌，即BM/pXY1?mtaA/mtaB/mtaC2和BM/pXY1?atoB/paaH/crt/bcd。重組菌株對甲醇利用和丁酸合成的能力顯著增強，在PB培養(yǎng)基中，甲醇的消耗能力分別提升了69％，14％。丁酸的產(chǎn)量分別提升了38％，28.6％。為進一步提高甲醇的消耗能力奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組食甲基丁酸桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

甲醇，是一種有刺激性氣味的無色透明液體。甲醇作為生物制造原料具有以下較明顯的優(yōu)勢：甲醇并且不需要壓縮和減壓安全性更高，更低的運輸成本；甲醇還原力高于葡萄糖，使用甲醇作為唯一的或輔助的碳源來生產(chǎn)包括有機酸在內(nèi)的還原性化學(xué)品，則有望獲得更高的產(chǎn)品產(chǎn)量。當前生產(chǎn)甲醇的主要方法是化學(xué)合成法，即加壓催化從化石燃料而來的合成氣、直接氧化甲烷、還原大氣中二氧化碳和氫氣來合成甲醇，由于生產(chǎn)甲醇的原材料豐富，建設(shè)項目大批涌現(xiàn)，甲醇產(chǎn)能持續(xù)快速增長。因此，近年來甲醇產(chǎn)能壓力過剩等問題日益加劇。尋找一種能夠?qū)⒓状甲鳛榈孜锷a(chǎn)各種化學(xué)品的方法，對于緩解甲醇產(chǎn)量過剩與需求不足之間的矛盾是至關(guān)重要的。

食甲基丁酸桿菌(Butyribacterium methylotrophicum)，細菌學(xué)分類為梭菌屬，是一種專性厭氧革蘭氏陽性芽孢桿菌。B.methylotrophicum可同時利用甲醇、CO、CO₂等碳一化合物進行發(fā)酵。當提供還原型基質(zhì)時，如CH₃OH-CO₂、CH₃OH-HCOOH等，即合成丁酸。因此，食甲基丁酸桿菌作為天然利用甲醇菌株，與好氧甲基營養(yǎng)菌有所不同，甲醇代謝途徑還原力消耗較少，主要用于代謝產(chǎn)物的積累，同時菌株具有對甲醇的耐受性高，代謝甲醇速率較快等優(yōu)勢，其發(fā)酵主要產(chǎn)物是羧酸、丁酸和相應(yīng)的醇類等，在生物制造業(yè)上有一定研究價值。

然而，目前的研究主要集中在食甲基丁酸桿菌的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基篩選等方面，并未涉及基因改造。食甲基丁酸桿菌中甲醇代謝主要分為三個模塊，第一個模塊為甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)能將甲醇的甲基轉(zhuǎn)移到甲基四氫葉酸中，該模塊的三個主要基因為mtaA,mtaB和mtaC2. 隨后通過WLP途徑的甲基分支，甲基四氫葉酸和二氧化碳被轉(zhuǎn)化乙酰-CoA。隨后，涉及丁酸合成途徑的幾個基因:atoB,paaH,crt和bcd等基因能將乙酰-CoA進一步轉(zhuǎn)化為丁酸。但食甲基丁酸桿菌對甲醇消耗速率以及丁酸生產(chǎn)效率方面仍有進一步提高的空間。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種重組食甲基丁酸桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，通過在食甲基丁酸桿菌中過表達甲醇利用途徑和丁酸合成途徑，提高了該菌株對于甲醇消耗能力以及丁酸合成能力。

為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種重組食甲基丁酸桿菌，所述重組食甲基丁酸桿菌通過轉(zhuǎn)入含有甲醇利用途徑相關(guān)基因或丁酸合成途徑相關(guān)基因的質(zhì)粒，獲得過表達甲醇利用途徑或丁酸合成途徑重組菌株；所述甲醇利用途徑相關(guān)基因和丁酸合成途徑相關(guān)基因的核苷酸序列分別如SEQ NO.1和SEQ NO.2 所示。

基于上述重組食甲基丁酸桿菌的構(gòu)建方法包括如下步驟：(1)分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和重組質(zhì)粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd；(2)對重組質(zhì)粒 pXY1-mtaA/mtaB/mtaC2和重組質(zhì)粒pXY1-atoB/paaH/crt/bcd分別進行甲基化修飾的重組質(zhì)粒；(3)再將分別甲基化修飾的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進入食甲基丁酸桿菌，構(gòu)建重組食甲基丁酸桿菌。