[發明專利]一種改造的酸性磷酸酶及其應用有效

申請號：	202110388771.2	申請日：	2021-04-12
公開（公告）號：	CN113088504B	公開（公告）日：	2022-10-11
發明（設計）人：	劉立明;徐歆;宋偉;陳修來;劉佳;高聰	申請（專利權）人：	江南大學
主分類號：	C12N9/16	分類號：	C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/04;C12R1/19
代理公司：	哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211	代理人：	張勇
地址：	214000 江蘇***	國省代碼：	江蘇;32
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種改造酸性磷酸酶及其應用
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【說明書】：

本發明公開了一種改造的酸性磷酸酶及其應用，屬于生物工程技術領域。本發明提供了一種改造的酸性磷酸酶PaAPasemu3，通過在大腸桿菌中表達所述改造的酸性磷酸酶PaAPasemu3，利用全細胞轉化法，將維生素C轉化為維生素C磷酸酯。并從反應的pH、溫度方面對改造的酸性磷酸酶PaAPasemu3的催化體系進行優化，可使得維生素C磷酸酯產量達到90.1 g/L，摩爾產率達75.1％。從而大大降低了之前的底物成本和環境污染等問題，為維生素C磷酸酯的工業化生產和綠色生產奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及一種改造的酸性磷酸酶及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術

維生素C磷酸酯作為一個維生素C的衍生物，其化學式為C₆H₆O₉P。它是由維生素C的碳骨架在2位橋連一個磷酸基。

目前，維生素C磷酸酯的主要生產方法為化學合成法，主要為基團保護法合成，但是這種方法雖然得率高，能耗卻較大，同時會對環境產生毒害作用，不符合綠色生產、安全生產和可持續發展的要求。通過生物法制備維生素C磷酸酯具有產品質量穩定安全、工藝條件溫和、高效、環保等特點，可以減輕環境和資源壓力，因此迫切需要一種有效的生物法高效制備維生素C磷酸酯。

目前，微生物法生產維生素C磷酸酯涉及到一個關鍵的酶酸性磷酸酶，它具有廣泛的底物譜，可以催化維生素C，使其C2位磷酸化，形成維生素C磷酸酯。而微生物法制備維生素C磷酸酯主要為酶轉化法。目前，由于酶轉化法具備環境友好、反應條件溫和及操作簡便等優點而更具備工業應用價值。但是，天然篩選的酸性磷酸酶本身存在水解能力，會水解產物，導致維生素C磷酸酯的產率低下，限制了酶轉化法大規模生產制備，提高酶酸性磷酸酶的磷酸化能力，減弱水解能力是目前研究的重點問題。

發明內容

在目前的研究中，酸性磷酸酶都會對產物進行水解，導致產量低。因而，為實現磷酸化反應，酶改造的酸性磷酸酶往往需要對特定的關鍵殘基進行突變改造的，以期來提高酶的實用性能。

本發明提供了酸性磷酸酶突變體，以來源于Pseudomonas aeruginosa的酸性磷酸酶為親本酶，所述酸性磷酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，將親本酶的第57位、第58位、第94位和第135位中的至少一個位點突變。

在一種實施方式中，所述突變體為(a)-(f)所示任一：

(a)第58位突變為F；

(b)第94位突變為F；

(c)第135位突變為R；

(d)第94位突變為F、第135位突變為R；

(e)第58位突變為P、第135位突變為R；

(f)第57位突變為H、第58位突變為P、第135位突變為R。

本發明提供了編碼所述突變體的基因。

本發明提供了攜帶所述基因的重組質粒。