[發明專利]基于CRSIPR技術構建14-3-3ε基因敲除細胞株的方法及其應用

有效

• 申請號: 202110386494.1
• 申請日: 2021-04-12
• 公開（公告）號: CN113186187B
• 公開（公告）日: 2023-03-17
• 發明（設計）人: 任濤;張殿宸;梁健鵬;向斌;林秋燕
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/12;C12N5/10
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞

本發明公開了一種基于CRSIPR技術構建14?3?3ε基因敲除細胞株的方法及其應用，屬于生物技術領域。本發明提供一種敲除14?3?3ε基因的sgRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發明利用CRISPR?Cas9技術首次在雞成纖維細胞系DF?1細胞基因組上敲除14?3?3ε基因，使得14?3?3ε蛋白的表達完全喪失，獲得14?3?3ε敲除的DF?1細胞株，且敲除細胞株活性、生長速度等方面均與對照細胞無明顯差異，是較為理想的DF?1敲除的細胞模型；操作簡便，周期短，成本低，改造后細胞株穩定，可用于研究14?3?3ε蛋白的生物學功能。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及基于CRSIPR技術構建14-3-3ε基因敲除細胞株的方法及其應用。

背景技術

14-3-3蛋白在大多數動植物中高度保守，哺乳動物細胞中有7種14-3-3蛋白亞型(β、γ、ε、σ、ζ、τ和η)。14-3-3家族的每個同工型可以形成同型或異型二聚體，作為分子伴侶蛋白主要結合磷酸化蛋白，并在受到刺激后調節其靶蛋白的細胞亞定位，從而調控如干擾素反應和細胞凋亡等多種細胞重要生理過程。研究顯示，寨卡病毒NS3蛋白通過結合并隔離14-3-3ε與14-3-3η蛋白，以拮抗視黃酸誘導基因1(retinoicacidinduciblegene-1,RIG-1)和黑色素瘤分化相關分子(MDA-5)誘導的干擾素反應。抑制14-3-3ε蛋白的表達后，丙肝病毒和仙臺病毒誘導的磷酸化干擾素調節因子3(Interferon regulatory Factor 3,IRF-3)減少，阻礙干擾素反應。丙肝病毒核心蛋白可以與14-3-3ε相互作用，調控Raf-1激酶活性并調節線粒體中BAX的釋放，從而控制宿主細胞的信號轉導和凋亡。使用14-3-3的抑制劑Difopein TFA或siRNA干擾14-3-3ε后能夠抑制高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)復制，過表達14-3-3ε導致HP-PRRSV復制增加。不難發現，14-3-3ε蛋白與多種病毒的感染致病過程密切相關，是今后研究病毒致病機制的一個重點。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出的特有免疫系統～CRISPR系統。利用這個系統，細菌可以把病毒基因從自己的染色體上切除。近年來，科學家們從細菌中解析了這個系統的關鍵蛋白(Cas9)，并掌握了這個關鍵蛋白的操作技術。以該關鍵蛋白為核心的復合物能在一段RNA的指導下，定向尋找目標DNA序列，然后編輯DNA以擾亂基因或插入想要的序列。CRISPR方法正快速超越鋅指核酸酶和其他編輯工具，能夠快速的對生物DNA序列進行修剪、切斷、替換或添加，且操作簡單，成本低廉。

發明內容

為了克服現有技術存在的缺點與不足，本發明的第一個目的在于提供一種敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列。

本發明的第二個目的在于提供一種基于CRSIPR技術構建14-3-3ε基因敲除細胞株的方法。

本發明的第三個目的在于提供一種14-3-3ε基因敲除細胞株。

本發明的第四個目的在于提供上述14-3-3ε基因敲除細胞株的應用。

本發明的目的通過如下方法制備得到：

一種敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列，其核苷酸序列為：5'-GGTTGAATCAATGAAGAAAG-3'。

一種基于CRSIPR技術構建14-3-3ε基因敲除細胞株的方法，包括如下步驟：

(1)根據上述敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列，在其5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸鏈，同時根據上述靶向敲除人P300基因的sgRNA序列獲得其對應的DNA互補鏈，在其5'端加上AAAC、3'端加上C得到反向寡核苷酸鏈，將合成的正向寡核苷酸鏈和反向寡核苷酸鏈變性、退火形成雙鏈；