[發明專利]基于CRSIPR技術構建14-3-3ε基因敲除細胞株的方法及其應用有效
| 申請號： | 202110386494.1 | 申請日： | 2021-04-12 |
| 公開（公告）號： | CN113186187B | 公開（公告）日： | 2023-03-17 |
| 發明（設計）人： | 任濤;張殿宸;梁健鵬;向斌;林秋燕 | 申請（專利權）人： | 華南農業大學 |
| 主分類號： | C12N15/113 | 分類號： | C12N15/113;C12N15/85;C12N15/12;C12N5/10 |
| 代理公司： | 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245 | 代理人： | 蘇運貞 |
| 地址： | 510642 廣*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基于 crsipr 技術 構建 14 基因 細胞株 方法 及其 應用 | ||
1.一種基于CRSIPR技術構建14-3-3ε基因敲除細胞株的方法，其特征在于：包括如下步驟：
(1)根據敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列，在其5'端加上CACCG得到正向寡核苷酸鏈，同時根據所述的敲除14-3-3ε基因的sgRNA序列獲得其對應的DNA互補鏈，在其5'端加上AAAC、3'端加上C得到反向寡核苷酸鏈，將合成的正向寡核苷酸鏈和反向寡核苷酸鏈變性、退火形成雙鏈；
(2)將步驟(1)制得的雙鏈與Cas9載體連接，得到重組敲除表達載體；
(3)將步驟(2)制得的重組敲除表達載體使用脂質體轉染法轉染雞成纖維細胞系DF-1細胞，培養，篩選穩轉細胞，得到14-3-3ε基因敲除細胞株；其中，
步驟（1）中敲除14-3-3ε基因的sgRNA的核苷酸序列為：5'-GGTTGAATCAATGAAGAAAG-3'；
步驟(2)中所述的Cas9載體為PX459載體；
步驟(4)中所述的篩選為嘌呤霉素篩選，篩選的操作為培養48 h后，先用含0.5 μg/mL嘌呤霉素的新鮮10% FBS的DMEM細胞培養液培養24 h，然后更換為含1 μg/mL嘌呤霉素的新鮮10% FBS的DMEM細胞培養液，繼續培養24 h以實現嘌呤霉素篩選。
2.根據權利要求1所述的基于CRSIPR技術構建14-3-3ε基因敲除細胞株的方法，其特征在于：
步驟(3)中所述的脂質體轉染法所用的脂質體為Lipofectamine 2000。
3.根據權利要求1所述的基于CRSIPR技術構建14-3-3ε基因敲除細胞株的方法，其特征在于：
步驟(4)中所述的DF-1細胞為處于對數生長期的細胞DF-1細胞。
4.一種14-3-3ε基因敲除細胞株，其特征在于：通過權利要求1-3任一項所述的方法制備得到。
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