[發明專利]植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法

有效

• 申請號: 202110384341.3
• 申請日: 2021-04-09
• 公開（公告）號: CN113109562B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發明（設計）人: 劉文博;凌飛;汪秀峰;馬卉;吳爽;許學
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院水稻研究所;武漢天問生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N33/543
• 代理公司: 合肥市浩智運專利代理事務所(普通合伙) 34124
• 代理人: 葉濛濛

本發明公開一種植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法，涉及植物分子檢測技術領域，本發明包括以下步驟：(1)多克隆抗體的制備；(2)植物組織提取液的制備；(3)將步驟(2)中的植物組織提取液加入微孔板中包被12?48h，然后倒出包被液并用PBST溶液清洗微孔板，加入PBS?milk溶液進行封閉；(4)封閉后將微孔板洗凈，加入一抗工作液孵育后洗凈，加入二抗工作液進行孵育，加入底物溶液，終止反應，測定吸光度值，將吸光度值代入標準曲線獲得EPSPS蛋白含量。本發明的優點為：對新型抗除草劑蛋白EPSPS進行定量檢測，所用耗材簡單易得，所用試劑無需復雜配制過程，成本低廉易于實施，具有普適性。

技術領域

本發明涉及植物分子檢測技術領域，具體涉及一種植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法。

背景技術

草甘膦是現代農業中應用最廣泛的一種廣譜性除草劑之一，而EPSPS基因是應用最廣泛的抗除草劑基因之一，農作物對草甘膦的抗性主要由EPSPS突變基因控制。

大豆和油菜生長期間氣候與田間環境非常適合農田雜草生長，雜草與大豆爭奪水分、養分和陽光，會造成大豆產量和品質下降，因此草害是影響大豆產量的主要因素之一。草甘膦作為廣譜高效，對動物低毒、成本較低并且可被土壤微生物降解的除草劑，在中國廣泛應用。草甘膦和抗除草劑大豆品種共同應用，是提高中國大豆產量與品質的最直接有效的方法。

綠色植物中莽草酸代謝途徑是植物生長發育的重要過程，該代謝過程最終產生芳香族氨基酸類物質。除草劑草甘膦通過抑制植物中的莽草酸代謝途徑，最終影響植物體中蛋白質正常代謝，引起植物枯死并達到除草目的。而抗草甘膦的植物由于含有抗草甘膦的EPSPS酶可催化被草甘膦抑制的代謝步驟，從而保證莽草酸代謝途徑的正常進行，保證植物正常生長不受草甘膦影響。

目前轉基因產品的種植面積巨大，大豆轉基因的目的一方面旨在品質改良，另一方面旨在提升大豆的抗病，抗蟲，耐除草劑等抗逆特性，常見的轉基因大豆外源基因包括Vip系列蛋白，pat基因，EPSPS抗除草劑基因等。其中耐除草劑基因除草劑大豆的研究應用范圍最為廣泛，最為常見。

轉基因油菜，是我國進口量第二大的轉基因農產品。轉基因油菜在全球油菜種植中占比也相當可觀。目前開放的油菜外源基因除了改善油脂特性的基因外，大部分仍是抗除草劑以及抗蟲基因。隨著種植轉基因植物的數量和品種在許多國家內逐年遞增，轉基因植物對人類健康和環境的影響越來越受到關注。因此，檢測轉基因植物中轉基因蛋白的定量技術逐漸成為研究熱點之一。如公開號為CN103698418A的專利公開一種植物中轉基因蛋白CP4-EPSPS的定量檢測方法，對現有技術中的CP4-EPSPS基因進行定量檢測。

公開號為CN 110699374A的專利申請公開一種抗草甘膦油菜的培育方法，其公開將CN103834674A專利中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因應用于油菜的培育，公開號為CN112322631A的專利申請公開將CN103834674專利中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因應用于大豆的培育。上述油菜和大豆均能保持相應的抗草甘膦除草劑特性，基因I.variabilis-EPSPS*在油菜基因組中的位置不同于任何其他任何含有類似基因的抗草甘膦油菜，同時對環境友好，具有廣泛的應用前景。植物中涉及的EPSPS蛋白是經過改造的EPSPS蛋白，盡管其功能未發生改變，但其序列已被改造，其在大豆和油菜組織中的表達量并不能依靠原有的普通EPSPS蛋白檢測方法進行檢測。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種針對新型抗除草劑蛋白EPSPS的定量檢測方法。

本發明通過以下技術手段實現解決上述技術問題：

一種植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法，包括以下步驟：

(1)多克隆抗體的制備：將如SEQ ID NO：1所示序列的EPSPS蛋白注入免疫兔進行免疫，然后進行采血純化，得到多克隆抗體；