[發(fā)明專利]植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110384341.3
• 申請日: 2021-04-09
• 公開（公告）號: CN113109562B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉文博;凌飛;汪秀峰;馬卉;吳爽;許學(xué)
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所;武漢天問生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N33/543
• 代理公司: 合肥市浩智運(yùn)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 34124
• 代理人: 葉濛濛

1.一種植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)多克隆抗體的制備：將如SEQ ID NO：1所示序列的EPSPS蛋白注入免疫兔進(jìn)行免疫，然后進(jìn)行采血純化，得到多克隆抗體；所述EPSPS蛋白的核苷酸序列合成的上、下游引物分別如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；

(2)植物組織提取液的制備：將植物組織用液氮研磨，用PBS溶液浸提，然后離心，獲得植物組織提取液，將植物組織提取液置于100℃加熱1min；

(3)將步驟(2)中的植物組織提取液加入微孔板中包被12-48h，然后倒出包被液并用PBST溶液清洗微孔板，加入PBS-milk溶液進(jìn)行封閉；

(4)封閉后將微孔板洗凈，加入一抗工作液孵育后洗凈，加入二抗工作液進(jìn)行孵育，充分洗凈后加入底物溶液，終止反應(yīng)，測定吸光度值，將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即獲得EPSPS蛋白含量；所述一抗工作液中的一抗為一抗為多克隆抗體，所述二抗工作液中的二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記小鼠抗兔IgG。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中植物組織提取液置于105℃加熱1min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中PBS溶液的pH值為7.4。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中PBST溶液中包括PBS溶液和吐溫-20，所述吐溫-20的加入體積為PBS溶液體積的0.05％。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中PBS-milk溶液包括PBS溶液和脫脂奶粉，所述脫脂奶粉按體積比為5％溶解于PBS溶液中。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中的包被時間為12h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法，其特征在于：所述步驟(4)中的反應(yīng)時間為30min，終止液為2M稀鹽酸。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法，其特征在于：所述步驟(4)具體包括：封閉后將微孔板洗凈，加入100μL一抗工作液孵育后洗凈，加入100μL二抗工作液進(jìn)行孵育，充分洗凈后加入100μL TMB底物溶液，室溫反應(yīng)30min后，加入50μL2M稀鹽酸終止反應(yīng)，測定吸光度值，將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即獲得EPSPS蛋白含量。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物中外源EPSPS蛋白的ELISA定量檢測方法，其特征在于：所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定包括以下步驟：將如SEQ ID NO：1的EPSPS蛋白稀釋至1μg/mL，然后逐級稀釋得到300ng/mL，200ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，10ng/mL，0ng/mL各100μL，將EPSPS蛋白溶液孵育過夜吸附到酶標(biāo)板表面后，依次加入一抗工作液、二抗工作液及底物，測定OD450數(shù)值。