[發(fā)明專利]一種用于篩選抗稻瘟病Pik位點新等位基因的引物和方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110382681.2
• 申請日: 2021-04-09
• 公開（公告）號: CN113122649A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周瑩;萬濤;邱文秀;王瓊;劉嵩
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢科技大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 武漢河山金堂專利事務(wù)所(普通合伙) 42212
• 代理人: 胡清堂

本發(fā)明公開了一種用于篩選抗稻瘟病Pik位點新等位基因的引物和方法，涉及分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，以水稻的基因組DNA為模板，采用該引物進行擴增，將擴增出的序列與已知等位基因的參考序列比對，根據(jù)Pikm1?TS的插入或者缺失數(shù)量的不同來確定新的Pik等位基因。該方法操作簡單、成本低廉，能夠高效的篩選出所需要的目的Pik新等位基因。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于篩選抗稻瘟病Pik位點新等位基因的引物和方法。

背景技術(shù)

水稻對全球糧食安全具有舉足輕重的作用，然而，由真菌稻瘟病菌引起的稻瘟病嚴重影響水稻的生長和產(chǎn)量。稻瘟病菌因其遺傳不穩(wěn)定性和致病性變異而聞名，由于致病變異頻繁，導(dǎo)致單一抗性品種的抗性會在種植3～5年時間后逐漸喪失，使得水稻品種抗性快速下降。而傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥方法在水稻生產(chǎn)過程中造成額外的成本和環(huán)境污染問題。因此，挖掘Pik位點廣譜抗性基因，延長這種重要作物的抗病壽命，成為近幾十年來研究的重點。從篩選的抗性品種中擴增并測序Pik位點的等位基因，分析結(jié)構(gòu)變異并了解Pik位點的等位基因的分子進化進行探討，證明Pik位點挖掘廣譜抗性基因在抗稻瘟病水稻方面的潛力，避開了傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥方法在水稻生產(chǎn)過程中造成額外的成本和環(huán)境污染問題，為減少稻瘟病對水稻生長和產(chǎn)量造成的危害提供了新的方向。

目前，在水稻11號染色體的抗稻瘟病Pik位點上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個等位基因，如Pi1、Pik-m和Pik-s等；研究表明，11號染色體長臂上的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的基因在我國水稻產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)出不同程度抗性。這些抗性基因在南方稻作區(qū)表現(xiàn)出優(yōu)異的抗性，而在北方表現(xiàn)出易感性。挖掘?qū)?yīng)用于北方水稻產(chǎn)區(qū)的廣譜抗病基因是一個重要目標，因為在北方地區(qū)培育含有多個抗病基因的品種將延緩這一重要水稻種植區(qū)對稻瘟病抗性的喪失。因此，對11號染色體長臂串聯(lián)重復(fù)區(qū)的Pik-m基因進行新等位基因挖掘，將有助于鑒定更多可在北方水稻產(chǎn)區(qū)應(yīng)用的抗性等位基因。

目前，常規(guī)的新等位基因挖掘的方法包括以下步驟：Pik遺傳位點的結(jié)構(gòu)分析，功能性分子標記的開發(fā)，基因組的DNA克隆，核苷酸序列比對等；試驗過程繁瑣、工程量大，操作周期比較長，且引物設(shè)計復(fù)雜，后續(xù)核苷酸不易比對，特異性差異也不明顯。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了用于篩選分抗稻瘟病Pik位點新等位基因的引物對和方法，能夠高效篩選出所需要的目的Pik位點新等位基因，并降低篩選成本。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

一種用于篩選抗稻瘟病Pik位點新等位基因的引物，所述引物為：

PikQ1P1-F：ACCCATTGCGAGAGGACCGAGAAA(SEQ ID NO.1)；

PikQ1P1-R：GAATAGGTCTGTGTTGCGAAATCT(SEQ ID NO.2)；

或

PikQ2P2-F：ATTGGACTATGGTGGAGACTGGGC(SEQ ID NO.3)；

PikQ2P2-R：CTAGTTCATGGCTACACCTCTCCC(SEQ ID NO.4)。

本發(fā)明還提供了篩選抗稻瘟病Pik位點新等位基因的方法，具體包括以下步驟：

S1、提取目標水稻的基因組DNA；

S2、以步驟S1所述基因組DNA為模板，使用PikQ1P1-F、PikQ1P1-R或PikQ2P2-F、PikQ2P2-R進行PCR擴增；

S3、對擴增所得產(chǎn)物進行測序、組裝，將組裝后的序列與Pik-m的序列進行比對，確定其插入或缺失數(shù)量并映射到等位基因的DNA序列。

進一步地，在上述技術(shù)方案中，步驟S2所述PCR的擴增條件如下：