[發明專利]一種鑒別粘蓋乳牛肝菌的核酸分子引物、方法及試劑盒

有效

• 申請號: 202110382675.7
• 申請日: 2021-04-09
• 公開（公告）號: CN113502344B
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 陳佳佳;劉國華;宋杰;于健;陳義彬;楊廣榮
• 申請（專利權）人: 江蘇農林職業技術學院;中國林業科學研究院熱帶林業研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 廣州駿思知識產權代理有限公司 44425
• 代理人: 李國釗

本發明公開了一種鑒別粘蓋乳牛肝菌的核酸分子引物、方法及試劑盒。所述核酸分子引物DNA序列為：C50F：CTGTCGCAGATATAGATGTAGA；C50R：CTTGAGGAGCCAGAGTGT。鑒別粘蓋乳牛肝菌的方法包括如下步驟：S1提取粘蓋牛肝菌待測樣品DNA；S2以樣品DNA為PCR擴增的模板，用核酸分子引物C50F和C50R作為擴增引物進行PCR擴增；S3對步驟S2的PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。本發明核酸分子引物可對粘蓋乳牛肝菌子實體和菌株進行快速的分子鑒定，具有很好的專一性，同時用料較少，僅20mg即可，方法簡單，2小時即可完成檢驗。

技術領域

本發明涉及分子生物學方法檢測食用菌技術領域，尤其是涉及一種鑒別粘蓋乳牛肝菌(Suillus bovinus)的核酸分子引物、方法及試劑盒。

背景技術

乳牛肝菌屬(Suillus)隸屬于真菌界(Fungi)、擔子菌門(Basidiomycota)、傘菌綱(Agaricomycetes)、牛肝菌目(Boletales)、乳牛肝菌科(Suillaceae)，是一類外生菌根真菌，可與多種樹木，特別是針葉樹種形成共生關系。Index Fungorum(http://www.indexfungorum.org)中乳牛肝菌物種記錄有509條。乳牛肝菌屬內除少數品種有毒或味苦而不能食用外，大部分品種均可食用。粘蓋乳牛肝菌(Suillus bovinus)主要分布于針葉林中，是一種非常名貴的食用菌，在云南、廣東、廣西等地區廣泛用于烹飪，富含多種蛋白質、維生素和抗氧化活性物質，而碳水化合物和脂肪的含量非常低，是非常健康的綠色食用菌類。由于乳牛肝菌屬內存在有毒及致幻的物種，因而進行物種的準確快速鑒別對于粘蓋乳牛肝菌的安全利用和開發具有總要價值。目前尚未有粘蓋乳牛肝菌相關的分子鑒定方法報道。

現今，基于核酸的快速檢測技術已被廣泛應用，特征性核苷酸序列具有一定的穩定性，不會受到外界因素的影響而改變，是該個體區別與其他個體的重要標志。Peptidasefamily C50(肽酶家族C50基因)是一類能夠水解肽鏈的酶，該基因家族在粘蓋乳牛肝菌基因組中出現顯著的擴張，產生5種不同的家族基因。基于此，本發明設計特有引物，通過PCR方法，專一地擴增粘蓋乳牛肝菌基因組(Lofgren et al.2021；https://mycocosm.jgi.doe.gov/mycocosm/home/releases？flt＝suillus)中獨有的肽酶家族C50基因(Gene ID：12967)，該基因在其他22種已知乳牛肝菌屬物種基因組中均不存在，通過電泳條帶結果鑒定粘蓋乳牛肝菌菌株和子實體。

發明內容

基于此，本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種鑒別粘蓋乳牛肝菌的核酸分子引物。

本發明采用的技術方案是：

一種鑒別粘蓋乳牛肝菌的特異引物C50F和C50R，其DNA序列為：

C50F：5’-CTGTCGCAGATATAGATGTAGA-3’(如SEQ ID NO.2所示)

C50R：5’-CTTGAGGAGCCAGAGTGT-3’(如SEQ ID NO.3所示)。

本發明的另一目的在于提供一種鑒別粘蓋乳牛肝菌的方法。

一種鑒別粘蓋乳牛肝菌的方法，采用上述的核酸分子引物，包括以下步驟：

S1：提取粘蓋牛肝菌待測樣品DNA；

S2：以樣品DNA為PCR擴增的模板，用核酸分子引物作為擴增引物進行PCR擴增，所述特異引物為：

C50F：5’-CTGTCGCAGATATAGATGTAGA-3’

C50R：5’-CTTGAGGAGCCAGAGTGT-3’；

S3：對步驟S2的PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。