[發(fā)明專利]一種病毒VP2蛋白分離純化的規(guī)模化生產(chǎn)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110381614.9
• 申請(qǐng)日: 2021-04-09
• 公開（公告）號(hào): CN113061166B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王青竹;鞠妍;高宏雷;劉景利;王曉龍;張峣;孫振峰;朱慶虎;王子敬;牛卉穎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/08
• 分類號(hào): C07K14/08;C07K1/14;C07K1/34
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

一種病毒VP2蛋白分離純化的規(guī)模化生產(chǎn)方法，屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域。為解決利用大腸桿菌表達(dá)傳染性法氏囊VP2蛋白生產(chǎn)雞傳染性法氏囊病疫苗會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素的問題，本發(fā)明提供了一種病毒VP2蛋白分離純化的規(guī)模化生產(chǎn)方法，該方法為將大腸桿菌破碎后，加入一定比例的脫氧膽酸鈉，然后加入有機(jī)磷酸鹽緩沖液作為螯合劑，調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)膒H，同時(shí)在溶液中加入一定濃度的NaCl，充分混勻后，利用中空纖維柱的切向流過濾功能，將內(nèi)毒素單體去除。本發(fā)明所述生產(chǎn)方法既能生產(chǎn)出高濃度的法氏囊VP2蛋白，又能符合新版獸藥GMP生產(chǎn)要求，具備低生產(chǎn)成本的特點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及的是一種病毒VP2蛋白分離純化的規(guī)模化生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

雞傳染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease virus,IBDV)引起的一種急性、高度傳染性的免疫抑制性疾病。IBDV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2含有血清型特異性、能誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的構(gòu)象依賴型抗原決定簇,其誘導(dǎo)的中和抗體能被動(dòng)地保護(hù)宿主不受IBDV的感染,是IBDV的主要保護(hù)性抗原,具有特異性,因而成為制備法氏囊病基因工程亞單位疫苗的主要蛋白。現(xiàn)有技術(shù)常利用能夠表達(dá)傳染性法氏囊病病毒的VP2基因的大腸桿菌生產(chǎn)VP2蛋白，進(jìn)而生產(chǎn)雞傳染性法氏囊病疫苗。該方法獲得法氏囊VP2蛋白需要先將大腸桿菌破碎，而大腸桿菌破碎不可避免的產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素，內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，叫做脂多糖。脂多糖對(duì)宿主是有毒性的。內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出來，所以叫做內(nèi)毒素。內(nèi)毒素位于細(xì)胞壁的最外層、覆蓋于細(xì)胞壁的黏肽上。各種細(xì)菌的內(nèi)毒素的毒性作用較弱，大致相同，可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等。因此如果不將內(nèi)毒素降低到一定范圍，就會(huì)對(duì)接種疫苗的動(dòng)物產(chǎn)生(嚴(yán)重)副反應(yīng)。

為了將大腸桿菌破碎產(chǎn)生的內(nèi)毒素控制在一定的范圍內(nèi)，就需要對(duì)法氏囊VP2蛋白進(jìn)行分離純化。現(xiàn)在去除內(nèi)毒素最常用也最有效的方式就是層析方法，但這種方法就是需要特殊的填料，而這種填料的成本也比較昂貴，已經(jīng)超出禽用疫苗的生產(chǎn)成本范圍。還有一種價(jià)格相對(duì)低廉的萃取方式，但這種方式需要反復(fù)的離心，離心過程中的一些操作方式有可能不符合新版的GMP規(guī)范要求。因禽用疫苗市場(chǎng)售價(jià)低廉，需控制生產(chǎn)成本，疫苗品質(zhì)必須保證，既要對(duì)蛋白進(jìn)行高濃度提純，又要控制純化過程中的成本，這就增加了后續(xù)分離純化的難度。因此，急需一種既能高濃度提純法氏囊VP2蛋白，又能降低生產(chǎn)成本的法氏囊VP2蛋白的分離純化的規(guī)模化生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為解決利用大腸桿菌表達(dá)傳染性法氏囊VP2蛋白生產(chǎn)雞傳染性法氏囊病疫苗會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素的問題，提供了一種符合生產(chǎn)成本要求和GMP規(guī)范的病毒VP2蛋白分離純化的規(guī)模化生產(chǎn)方法，具體生產(chǎn)方法如下：

步驟一、表達(dá)法氏囊病病毒的VP2基因的大腸桿菌菌體經(jīng)裂解液重懸、高壓勻質(zhì)機(jī)破碎及離心后獲得菌液；

步驟二、將步驟一獲得的菌液放入超濾孔徑的中空纖維柱中，在封閉透出端后，進(jìn)行反復(fù)沖刷，然后打開透出端，調(diào)整流速，將柱內(nèi)體積濃縮至原體積的1/5-1/10后關(guān)閉透出端；

步驟三、向柱內(nèi)加入等體積的PB緩沖液，關(guān)閉透出端，柱內(nèi)循環(huán)15min-30min，打開透出端，將菌液體積再次濃縮至加入緩沖液之前的體積，然后用PB緩沖液對(duì)菌液進(jìn)行連續(xù)洗濾，直至透出端廢液體積達(dá)到罐內(nèi)液體體積的4-8倍；

步驟四、向步驟三獲得的菌液中加入等體積的含有脫氧膽酸鈉和氯化鈉的混合液，調(diào)節(jié)pH至7.0-7.5，關(guān)閉透出端閥門，柱內(nèi)循環(huán)15min-30min，然后用含有脫氧膽酸鈉和氯化鈉的PB緩沖液對(duì)菌液進(jìn)行連續(xù)洗濾，直至透出端廢液體積達(dá)到罐內(nèi)液體體積的5-10倍完成整個(gè)工藝流程。

進(jìn)一步地限定，步驟一所述裂解液為0.1mol/L-0.3mol/L的PB緩沖液，大腸桿菌菌體濕菌重與裂解液的體積比為1:10。