[發明專利]一種用于治療β-地中海貧血的慢病毒載體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202110379047.3
• 申請日: 2021-04-08
• 公開（公告）號: CN112921054B
• 公開（公告）日: 2023-01-24
• 發明（設計）人: 程濤;楊智學;張健萍;張鳳;殷夢迪;趙梅;許靜;張孝兵
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院血液病醫院（中國醫學科學院血液學研究所）
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/12;C12N15/113;C12N7/01;A61K38/42;A61P7/06;C12R1/93
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供了一種用于治療β?地中海貧血的慢病毒載體及其制備方法和應用，所述慢病毒載體包括HBB表達框；所述HBB表達框包括串聯的DNase I高敏位點、啟動子、HBB編碼基因和增強子；所述DNase I高敏位點包括串聯表達的HS4、HS3和HS2；所述HBB編碼基因包括T87Q突變。本發明通過精簡順式調控元件的長度、使用突變型HBG啟動子、優化啟動子長度、對潛在的轉錄終止信號進行沉默突變等多種手段，開發出了新型慢病毒載體，所述慢病毒載體能夠實現β?珠蛋白過表達，其中HBB表達模塊總長度約5kb，與BB305載體相比，載體滴度提高了2～4倍，紅系分化后β?珠蛋白表達水平提高了2倍左右。

技術領域

本發明屬于生物醫學技術領域，涉及一種用于治療β-地中海貧血的慢病毒載體及其制備方法和應用。

背景技術

β-地中海貧血是最常見的單基因遺傳病之一，患者體內的β-珠蛋白(β-globin，HBB)編碼基因發生突變，造成β-珠蛋白肽鏈合成不足。血紅蛋白作為紅細胞運輸氧氣的載體，是由兩條α-珠蛋白鏈和兩條β-珠蛋白鏈組成的四聚體。HBB基因突變使得血紅蛋白的α、β兩種亞基比例失衡，無法形成功能性血紅蛋白，同時引發溶血性貧血，最終使機體氧氣供應嚴重不足，造成多種器官損傷，重者可危及生命。

當前，臨床上廣泛實施的β-地中海貧血的治療手段包括規范化輸血、藥物治療、異體造血干細胞移植等。其中，規范化輸血僅能緩解癥狀，不能根治疾病，病人還需長期依賴于祛鐵治療以降低鐵過載損傷；此外，長期輸血還存在感染病毒的可能性，同時治療成本高昂。異體造血干細胞移植雖然可以達到根治地中海貧血的目的，但是80％以上的病人難以找到組織相容性抗原匹配的供者，若采用非全相合的造血干細胞進行移植，患者可能產生嚴重的移植物抗宿主反應，在治療后需要長期使用免疫抑制劑，生存質量低下。目前普遍認為基因治療是根治β-地中海貧血的重要替代方法。

針對β-地中海貧血的基因治療有兩種主流方法：1)基于珠蛋白的時空順序性開關轉換過程，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術敲除或敲低該過程中參與調控的BCL11A等基因，從而重新激活HBG1/2(胎兒γ-珠蛋白)；2)通過慢病毒載體整合補償策略過表達HBB(成人β-珠蛋白)。

其中，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術再激活HBG表達的地中海貧血基因治療應用研究已取得顯著進展，但是該方案可能存在一些潛在的問題，基因編輯治療方法雖然值得期待，但是其安全性和療效需要進一步驗證，目前尚不能取代傳統的慢病毒載體基因治療方法。

用于治療β-地中海貧血的慢病毒載體根據β-珠蛋白基因簇的調控元件特征，將基因座控制區(locus control region，LCR)的相關核心序列(HS2-3-4，相當于超級增強子)與HBB基因表達框串聯，組裝成精簡的HBB表達模塊，反向裝載到慢病毒載體上。慢病毒轉導造血干細胞后，其裝載的表達模塊將整合到造血干細胞基因組中，在造血干細胞向紅系分化過程中，紅系特異性轉錄因子將識別并結合逐漸開放的HS4-3-2增強子和HBB啟動子區域，激活外源性HBB基因的表達。

利用慢病毒載體進行地中海貧血的基因治療已經有近二十年的研究歷程，目前國際同行已經開發出多種慢病毒載體，如BB305、GLOBE、HPV56等，其中，藍鳥公司基于BB305載體的藥物Zynteglo已經獲歐盟批準上市，報價177萬美元，成為目前全球第二昂貴的藥物。雖然慢病毒載體的HBB整合補償策略已經在臨床試驗中取得顯著成效，但是當前的商業化慢病毒載體存在諸如LCR元件較大導致慢病毒包裝滴度低、載體生產成本高等問題，仍然有很大的改進空間。

目前使用的慢病毒載體基本上是10年前設計的，過去10年來由于基因組學、二代測序技術的進步和慢病毒生物學的不斷發展，對慢病毒載體進行新的技術創新的條件已經成熟，有利于開發出效果更好、成本更低的慢病毒載體治療藥物。

發明內容