[發(fā)明專利]基于單個探針的自引物恒溫指數(shù)擴增方法在檢測長鏈核酸中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110376763.6
• 申請日: 2021-04-08
• 公開（公告）號: CN113186261A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳俊;黃婷;劉碧蓉;楊子中;孫蒙旭;陳金香;謝寶平;段文軍
• 申請（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

本發(fā)明公開了一種基于單個探針的自引物恒溫指數(shù)擴增方法在檢測長鏈核酸中的應(yīng)用，其中，所述方法包括如下步驟：(1)設(shè)計自引物擴增模板發(fā)卡；(2)反轉(zhuǎn)錄待測樣品RNA為待測樣品DNA，以待測樣品DNA為模板，與所述自引物擴增模板發(fā)卡進行等溫擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的熒光信號強度計算待測樣品中的長鏈核酸含量；其中，所述長鏈核酸為堿基長度大于1000的核酸序列。本發(fā)明中的檢測方法相比傳統(tǒng)EXPAR，無需額外引入新的引物探針即可實現(xiàn)長鏈核酸的高靈敏高特異性檢測，極大地簡化了方法復(fù)雜度和降低了非特異性擴增。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明是屬于基因檢測領(lǐng)域，具體涉及基于單個探針的自引物恒溫指數(shù)擴增方法在檢測長鏈核酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

恒溫核酸擴增技術(shù)是一類在恒溫條件下進行核酸擴增的技術(shù)。相比PCR技術(shù)，恒溫核酸擴增無需繁瑣的變溫步驟，且擴增效率與PCR相當(dāng)，可以廣泛用于miRNA、DNA、mRNA、病毒RNA、蛋白質(zhì)的檢測。

恒溫核酸擴增可分為無生物酶參與的擴增和基于生物酶的擴增反應(yīng)。無生物酶參與的反應(yīng)包括雜交鏈反應(yīng)和催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)，雖然該反應(yīng)無需生物酶的參與，在一定程度上降低了成本，但是該方法擴增效率低且反應(yīng)耗時長。而基于生物酶參與的恒溫擴增，如滾環(huán)擴增(RCA)、環(huán)介導(dǎo)指數(shù)擴增(LAMP)、恒溫指數(shù)擴增(EXPAR)可以在聚合酶或切口酶等生物酶的輔助下實現(xiàn)高擴增效率和高擴增速率，但該方法對于基于目標(biāo)物觸發(fā)的單個探針的擴增反應(yīng)的特異性低，對于長鏈樣品的擴增效果和效率較差，無法得到有效的推廣使用。

因此，開發(fā)一種可以基于單個探針，且具有較高特異性的自引物恒溫指數(shù)擴增方法對于長鏈核酸檢測具有極為重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出一種針對于長鏈核酸的基于單個探針的自引物恒溫指數(shù)擴增方法，能夠克服傳統(tǒng)方法對于長鏈核酸(如mRNA、病毒RNA)中間保守區(qū)域幾十個堿基長度的片段時，其3’端無法直接作為引物觸發(fā)擴增的問題，在無需額外添加引物探針的基礎(chǔ)上實現(xiàn)擴增，降低了額外引物探針的引入導(dǎo)致的非特異性擴增問題，簡化了檢測方法，實現(xiàn)了長鏈核酸高靈敏高特異性檢測。

本發(fā)明的第一個方面，提供一種長鏈核酸的檢測方法，包括如下步驟：

(1)設(shè)計自引物擴增模板發(fā)卡，所述自引物擴增模板發(fā)卡的頸部序列長度為11～15nt；

(2)反轉(zhuǎn)錄待測樣品RNA為待測樣品DNA，以待測樣品DNA為模板，與所述自引物擴增模板發(fā)卡進行等溫擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的熒光信號強度計算待測樣品中的長鏈核酸含量。

根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，在本發(fā)明的一些實施方式中，所述長鏈核酸為堿基長度大于1000的核酸序列。

在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式中，所述長鏈核酸為堿基長度大于1000的mRNA、lncRNA、RNA病毒基因組和RNA片段。

利用常規(guī)的檢測方法，如qPCR法檢測長鏈核酸，在檢測過程中，在面對長鏈核酸(如mRNA、病毒RNA)中間保守區(qū)域幾十個堿基長度的片段時，存在3’端無法直接作為引物觸發(fā)擴增的問題，其必須通過加入額外的引物探針才能實現(xiàn)擴增，而額外引物探針的引入容易導(dǎo)致非特異性擴增而且使檢測方法趨向于復(fù)雜化，不利于方法的推廣。而對于滾環(huán)擴增(RCA)、環(huán)介導(dǎo)指數(shù)擴增(LAMP)、恒溫指數(shù)擴增(EXPAR)，雖然具有高擴增效率和高擴增速率的特性，但該方法對于基于目標(biāo)物觸發(fā)的單個探針的擴增反應(yīng)的特異性低，對于長鏈樣品的擴增效果和效率較差，無法得到有效的推廣使用。