[發明專利]基于單個探針的自引物恒溫指數擴增方法在檢測長鏈核酸中的應用

在審

• 申請號: 202110376763.6
• 申請日: 2021-04-08
• 公開（公告）號: CN113186261A
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 陳俊;黃婷;劉碧蓉;楊子中;孫蒙旭;陳金香;謝寶平;段文軍
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/70;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 胡輝

1.一種長鏈核酸的檢測方法，包括如下步驟：

(1)設計自引物擴增模板發卡，所述自引物擴增模板發卡的頸部序列長度為11～15nt；

(2)反轉錄待測樣品RNA為待測樣品DNA，以待測樣品DNA為模板，與所述自引物擴增模板發卡進行等溫擴增，根據擴增產物的熒光信號強度計算待測樣品中的長鏈核酸含量；

其中，所述長鏈核酸為堿基長度大于1000的核酸序列。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述長鏈核酸為堿基長度大于1000的mRNA、lncRNA、RNA病毒基因組和RNA片段。

3.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中所述等溫擴增的反應體系為：

其中，所述10×Nt.AiwI核酸內切酶緩沖液中含有50mM CH₃COOK，20mM Tris-醋酸，10mMMg(CH₃COO)₂,，100μg/mL BSA，pH為7.9；

所述Klenow fragment(3'→5'exo-)聚合酶聚合酶緩沖液中含有10mM Tris-HCl，50mMNaCl，10mM MgCl₂，1mM二硫蘇糖醇，pH為7.9。

4.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中所述等溫擴增的反應程序為：36～38℃下擴增60min。

5.根據權利要求1～4任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述長鏈核酸為豬瘟病毒基因組和/或其RNA片段。

6.一組自引物擴增模板發卡，其特征在于，所述自引物擴增模板發卡的核苷酸序列為：

HP-11nt：5'-CGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGATAGATCCGCGTAGGTACTAACCCACCTCGAGTATTCCTACGC-3'(SEQ ID NO.7)；

HP-12nt：5'-CGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGATAGATCCGCGTAGGTACTAACCCACCTCGAGTATTCCTACGC-3'(SEQ ID NO.8)；

HP-13nt：5'-CGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGACGAGACGCGTAGGTACTAACCCACCTCGAGATCCTACGC-3'(SEQ ID NO.9)；

HP-14nt：5'-CGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGATAGATCCGCGTAGGTACTAACCCACCTCGAGATTTCCTACGC-3'(SEQ ID NO.10)；

HP-15nt：5'-CGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGATAGATCCGCGTAGGTACTAACCCACCTCGAGATGCCCTACGC-3'(SEQ ID NO.11)。

7.一種檢測制劑，其特征在于，所述檢測制劑中含有權利要求6所述的自引物擴增模板發卡。

8.根據權利要求7所述的檢測制劑，其特征在于，所述檢測制劑中含有SEQ ID NO.9所示序列。

9.權利要求7或8所述的檢測制劑在制備豬瘟病毒檢測試劑盒中的應用。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述豬瘟病毒為含有SEQ ID NO.2所示序列的豬瘟病毒基因組或RNA片段。