[發(fā)明專利]采用功能化磁珠進(jìn)行生物正交化學(xué)的大分子一步捕獲方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110376388.5
• 申請日: 2021-04-06
• 公開（公告）號: CN113092784B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李楠;王蕾;王維杰;趙文娟
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12N15/10
• 代理公司: 北京華仁聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11588
• 代理人: 周明新

本發(fā)明提供一種功能化磁珠及采用其的生物正交化學(xué)的大分子一步捕獲方法，該功能化磁珠為非偶聯(lián)抗體小分子修飾的磁珠，利用該磁珠捕獲大分子的方法不涉及抗原抗體反應(yīng)，采用點(diǎn)擊化學(xué)中的疊氮炔環(huán)加成反應(yīng)原理，避免了非特異性結(jié)合蛋白的產(chǎn)生，一步法捕獲蛋白質(zhì)生物大分子，更加直接、高效、背景更低，且適用于變性條件下的蛋白捕獲，適用性更廣泛。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物大分子捕獲技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種功能化磁珠及采用其的生物正交化學(xué)的大分子一步捕獲方法。

背景技術(shù)

每個細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)信號傳遞和細(xì)胞間通信主要依賴于蛋白質(zhì)的功能及其特定的相互作用，因此，研究蛋白質(zhì)相互作用是破譯細(xì)胞生命活動的關(guān)鍵。然而一個哺乳動物細(xì)胞約有一萬種不同的蛋白質(zhì)，發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)通常是低豐度的，含量只有不到1％，對于深入鑒定細(xì)胞的整個蛋白質(zhì)組來說將會是巨大的挑戰(zhàn)，即使是當(dāng)今最先進(jìn)的質(zhì)譜儀，由于有限的檢測速度和動態(tài)檢測范圍，也無法做到低豐度蛋白質(zhì)的完全鑒定。如果要鑒定時間和空間方面特征的亞蛋白質(zhì)組，那么這將會是一項(xiàng)更加困難的任務(wù)，關(guān)鍵之處在于亞蛋白質(zhì)組的分離和富集。為了對新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，已有研究者開發(fā)了一種生物正交非天然氨基酸標(biāo)記技術(shù)(BONCAT,bioorthogonal?noncanonical?amino?acid?tagging)，這種技術(shù)是利用細(xì)胞自身翻譯機(jī)制，使人們能夠用生物正交非天然氨基酸來標(biāo)記、識別和富集新合成的蛋白質(zhì)亞群,也能結(jié)合亞細(xì)胞分離技術(shù)獲得蛋白質(zhì)在空間分布上的新合成蛋白質(zhì)及其互作蛋白信息。

在調(diào)控生命活動的過程中，除了蛋白質(zhì)之間的相互作用，RNA和蛋白質(zhì)之間也會發(fā)生互作，從而調(diào)節(jié)彼此的功能，RNA與蛋白質(zhì)的相互作用對于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是非常重要的，而干擾兩者的相互作用會造成細(xì)胞功能失調(diào)和相關(guān)疾病的發(fā)生。因此研究和鑒定RNA的相互作用網(wǎng)絡(luò)，有助于科學(xué)家解決特定研究問題。而最新的研究方法也應(yīng)用到生物正交非天然核苷酸標(biāo)記技術(shù)，是利用非天然核苷酸在DNA轉(zhuǎn)錄時嵌入到新轉(zhuǎn)錄的RNA中，可以對新轉(zhuǎn)錄的RNA或新轉(zhuǎn)錄的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行標(biāo)記、識別和富集，后續(xù)進(jìn)行RNA測序以及質(zhì)譜分析，可以鑒定并得到RNA及其互作蛋白的信息。

上述兩種生物大分子標(biāo)記技術(shù)涉及了點(diǎn)擊化學(xué)(click?chemistry)反應(yīng)和親和純化技術(shù)。

點(diǎn)擊化學(xué)(click?chemistry)反應(yīng)是由化學(xué)家K.B.Sharpless在2001年引入的一種化學(xué)合成概念，其代表反應(yīng)是疊氮炔環(huán)加成反應(yīng)，在亞銅離子的催化下，疊氮(azide)基團(tuán)和炔基(alkyne)反應(yīng)生成三唑環(huán)(triazole)，從而把想要的官能團(tuán)鏈接起來。親和純化技術(shù)：通過給蛋白質(zhì)添加標(biāo)簽，例如：His、GST、HA及FLAG等，利用標(biāo)簽與其特異性配體之間的特異親和力，使用特異性配體修飾的固相載體對標(biāo)簽化蛋白進(jìn)行捕獲，從而達(dá)到分離純化的目的。

文獻(xiàn)1“BONCAT:Metabolic?Labeling,Click?Chemistry,and?AffinityPurification?of?Newly?Synthesized?Proteomes”(DOI:org/10.1007/978-1-4939-2272-7_14)公開了生物正交非天然氨基酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)相互作用的捕獲方法，如圖1所示，細(xì)胞在培養(yǎng)時添加疊氮化非天然氨基酸，新合成的蛋白質(zhì)(橙色)會含有疊氮基團(tuán)，可通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將帶有炔基的生物素親和標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記。生物素和鏈霉親和素可以發(fā)生特異性結(jié)合，標(biāo)記的新合成蛋白可以通過Western?blot分析或使用含有鏈霉親和素的固相載體進(jìn)行親和純化、質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)信息。