[發明專利]采用功能化磁珠進行生物正交化學的大分子一步捕獲方法及應用

有效

• 申請號: 202110376388.5
• 申請日: 2021-04-06
• 公開（公告）號: CN113092784B
• 公開（公告）日: 2023-09-08
• 發明（設計）人: 李楠;王蕾;王維杰;趙文娟
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12N15/10
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司 11588
• 代理人: 周明新

1.一種生物正交化學的大分子一步捕獲方法，其特征在于，包括：

第一步，配置300-600mmol/L硫酸銅水溶液、0.5mol/L-1.5mol/L抗壞血酸鈉水溶液、50mmol/L-150mmol/L(三(3-羥丙基三氮基甲基)胺)水溶液、0.5％-1.5％十二烷基硫酸鈉水溶液、30-60mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸水溶液、6mol/L-10mol/L尿素水溶液、20％-40％乙腈水溶液；

第二步，取磁珠懸液，使用蛋白或核酸緩沖液置換，重懸于蛋白緩沖液中；

第三步，按順序依次加入硫酸銅水溶液、抗壞血酸鈉水溶液、(三(3-羥丙基三氮基甲基)胺)水溶液、待捕獲的蛋白樣品、第二步制備的磁珠懸液和超純水，體積比為0.1-0.3∶1∶0.3-0.5∶1-1.5∶15-25∶20-25；

第四步，配置好反應混合液后，放在恒溫混勻儀上，孵育；溫度為25℃，轉速1200rpm-2000rpm，孵育0.5-1.5小時；

第五步，磁性分離1～3min，去除上清液；

第六步，還原烷基化；向樣品中加入還原烷基化試劑，包括：500mM三(2-羧乙基)膦，1M氯乙酰胺，10％SDS，50mM?4-羥乙基哌嗪乙磺酸，在37℃孵育30min，隨后磁性分離去除上清液；

第七步，洗滌磁珠；依次采用十二烷基硫酸鈉水溶液洗滌3-5次，尿素溶液洗滌3-5次，乙腈洗滌3-5次，4-羥乙基哌嗪乙磺酸水溶液洗滌3-5次；

第八步，磁珠上的蛋白經胰蛋白酶消化，用于LC-MS分析；

生物大分子為進行了炔基化或疊氮化的蛋白質或核酸；

所述磁珠為炔基化磁珠或疊氮化磁珠；

所述炔基化磁珠采用NH₂-PEG4-Alkyne與羧基磁珠偶聯合成；制備方法包括：

第一步，羧基磁珠懸液置于離心管中，放在磁力架上等待1-3min，進行磁性分離，用移液器吸走并丟棄上清液；

第二步，在分離產物中加入有機溶劑，每1ml第一步使用的羧基磁珠懸液使用1ml有機溶劑，使用移液器緩慢吹打8-12次，以重懸磁珠，再次磁性分離1-3min，去除上清液，重復洗滌3-5次分離產物，重懸磁珠在有機溶劑中，獲得磁珠懸液；所述有機溶劑為DMF；

第三步，配置第一溶液，第一溶液為N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，濃度為5-15mg/mL；

第四步，配置第二溶液，第二溶液為NH₃-PEG4-Alkyne，濃度為150mg/mL-250mg/mL；

第五步，將第三步獲得的第一溶液加入第二步獲得的磁珠懸液中，添加量為1ml磁珠懸液對應5ml第一溶液；

第六步，將第二溶液加入第五步獲得的磁珠懸液中，添加量為1ml磁珠懸液對應10μl第二溶液；

第七步，將第六步獲得的混合液置于37℃搖床中，搖晃孵育1-3小時；

第八步，磁性分離1-3min，去除上清液；

第九步，加入乙醇溶液，進行吹打重懸，磁性分離1-3min，去除上清液，對分離產物重復洗滌4-6次，最后重懸磁珠在乙醇水溶液中；所述乙醇溶液濃度10％-30％；

第十步，該磁珠懸液保存于4℃，避免凍結；

所述疊氮化磁珠采用疊氮基丙胺與羧基磁珠偶聯合成，制備方法包括：

第一步，羧基磁珠懸液置于離心管中，放在磁力架上等待1-3min，進行磁性分離，用移液器吸走并丟棄上清液；

第二步，在分離產物中加入有機溶劑，每1ml第一步使用的羧基磁珠懸液使用1ml有機溶劑，使用移液器緩慢吹打8-12次，以重懸磁珠，再次磁性分離1-3min，去除上清液，重復洗滌3-5次分離產物，重懸磁珠在有機溶劑中，獲得磁珠懸液；所述有機溶劑為DMF；

第三步，配置第一溶液，第一溶液為N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，濃度為5-15mg/mL；

第四步，配置第二溶液，第二溶液為疊氮基丙胺，濃度為150mg/mL-250mg/mL；

第五步，將第三步獲得的第一溶液加入第二步獲得的磁珠懸液中，添加量為1ml磁珠懸液對應5ml第一溶液；

第六步，將第二溶液加入第五步獲得的磁珠懸液中，添加量為1ml磁珠懸液對應10μl第二溶液；

第七步，將第六步獲得的混合液置于37℃搖床中，搖晃孵育1-3小時；

第八步，磁性分離1-3min，去除上清液；

第九步，加入乙醇溶液，進行吹打重懸，磁性分離1-3min，去除上清液，對分離產物重復洗滌4-6次，最后重懸磁珠在乙醇水溶液中；所述乙醇溶液濃度10％-30％；

第十步，該磁珠懸液保存于4℃，避免凍結。

2.如權利要求1所述生物正交化學的大分子一步捕獲方法，其特征在于：點擊化學反應為疊氮炔環加成反應。