[發明專利]一種眼鏡蛇毒注射用NGF的制備方法

在審

• 申請號: 202110372927.8
• 申請日: 2021-04-07
• 公開（公告）號: CN113416242A
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 白育林;袁樹成
• 申請（專利權）人: 云南龍鳳谷生物藥業有限公司;白育林
• 主分類號: C07K14/48
• 分類號: C07K14/48;C07K1/16;C07K1/14
• 代理公司: 北京智橋聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11560
• 代理人: 張衛武

本發明涉及一種眼鏡蛇毒注射用NGF的制備方法，將眼鏡蛇粗毒進行兩次凝膠層析，其中凝膠層析Ⅰ為SP?Sephadex G?25柱層析，凝膠層析Ⅱ為Acta Rosorse柱層析，在凝膠層析Ⅰ之前對加入緩沖液的蛇毒和凝膠層析Ⅰ后對于粗蛇毒神經生長因子液進行冷凍處理。本發明提供的眼鏡蛇毒神經生長因子制備方法簡單易行、可用于工業化放大生產、活性損失小，活性損失小于10％的蛇毒NGF；可以打破蛋白質分離的常規限制，使用更高初始濃度的粗蛇毒液也可以進行有效分離；生產效率高、成本合理，特別適合工業化規模生產；得率高，超過0.6％，甚至能達到0.7％以上。

技術領域

本發明涉及一種眼鏡蛇毒神經生長因子的制備方法，具體涉及一種通過層析從眼鏡蛇毒中分離純化神經生長因子的方法。

背景技術

神經生長因子(Nerve Growth Factor,NGF)、類神經生長因子是一種對多種細胞和神經元生長、發育有重要調節作用的生物活性多肽。從1984年人類發現NGF并于1986年獲得諾貝爾獎，至今已經發現NGF對于維持交感神經和感覺神經細胞生長，促進神經元生長、發育、新陳代謝，維持大腦的正常機能及調節內分泌和免疫系統等方面發揮著重要的作用，是治療腦損傷、老年性癡呆、腦膜炎、血管神經性頭疼、帕金森氏綜合癥等與神經損傷和神經退行有關的疾病的理想藥物。

神經損傷一直被認為是不可逆的損傷，而且其引起的疾病常常導致生活不能自理，生活質量嚴重下降，無論給患者本身還是社會都會帶來沉重負擔，因而國內外大藥企，特別是國外藥企一直在研究相關藥物，NGF是其中一個重要方向。目前人體b亞基和小鼠頜下腺NGF 等多種天然基因藥物國外正在進行開發研究。蛇毒中富含NGF，且我國飼養蛇古已有之，是良好的NGF來源。

從蛇毒中提取NGF的方法已經有大量研究，通常有分子篩層析、離子交換層析、親和層析和基因工程制備等方法。分子篩層析，離子交換層析是最常用的方法，但缺點是步驟繁瑣，蛋白的活性損失大。部分眼鏡蛇毒NGF分離過程還要其他方法輔助。從分離介質的化學穩定性、商品的可獲得性和商品成本方面考慮，具有實際用途的方法則是比較經典的、且在文獻上大量使用的凝膠過濾+離子交換+凝膠過濾模式。但是這種方法存在這以下兩個致命的弱點： (1)第一步的凝膠過濾過程中一般都需要100多個小時，不但操作時間長，而且蛋白與介質的長時間接觸，使得所需的目標蛋白的活性有可能降低。(2)在第一步中采用的凝膠過濾法，由于凝膠介質吸附容量較小，使得樣品的處理量很小，因此，只能用于實驗室少量樣品的制備，很難放大到中試和生產規模上。

可以說，盡管在實驗室里進行了大量研究，目前仍然沒有工業級別、產率高、活性損失小、生產效率高的蛇毒NGF制備方法，特別是沒有可用于注射液的蛇毒NGF制備方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種從眼鏡蛇毒中提取純化注射用NGF的方法，該方法生效效率高、NGF純度好、收率高，可適應工業化大規模生產。

在一方面，本發明提供一種從眼鏡蛇毒中提取純化注射用NGF的方法，包括：

將眼鏡蛇粗毒進行兩次凝膠層析，其中凝膠層析Ⅰ為SP-Sephadex G-25柱層析，凝膠層析Ⅱ為Acta Rosorse柱層析或或Hplc Resours柱層析；在凝膠層析Ⅰ之前對加入緩沖液的蛇毒和凝膠層析Ⅰ后對于粗蛇毒神經生長因子液進行冷凍處理。

所述冷凍處理可以是選自常規冷凍、CAS冷凍、高壓冷凍、磁共振冷凍技術、微波輻射冷凍、超聲波冷凍、真空冷凍中的一種。優選的，所述冷凍處理選自CAS冷凍、真空冷凍、超聲冷凍和微博輻射冷凍，更為優選的所屬冷凍處理選自CAS冷凍、真空冷凍、超聲冷凍。

所述凝膠層析的溫度優選在較低的溫度下進行，例如低于25℃，更優選的低于20℃，更加優選的低于10℃，還可以在更低溫度，例如4℃以下進行。