[發明專利]一種改良L-15培養基及其在培養對蝦肌肉細胞中的應用

有效

• 申請號: 202110370342.2
• 申請日: 2021-04-07
• 公開（公告）號: CN113025557B
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發明（設計）人: 葉超霞;鄒丹陽
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 郭煒綿

本發明公開了一種改良L?15培養基及其在培養對蝦肌肉細胞中的應用。所述的改良L?15培養基含有10mmol/L丙氨酸、3mmol/L甘氨酸、3mmol/L絲氨酸、1.5mmol/L組氨酸、0.5mmol/L賴氨酸、1.5mmol/L精氨酸、1.5mmol/L纈氨酸、1mmol/L蘇氨酸、0.5mmol/L蛋氨酸、0.5mmol/L亮氨酸、5mmol/L天冬氨酸、0.5mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L苯丙氨酸；還含有?；撬?、脯氨酸、谷氨酸、胎牛血清、雙抗，pH值為7.2?7.4。本發明的改良L?15培養基提高了南美白對蝦原代肌肉細胞的存活率和貼壁率，改善細胞生長狀態。

技術領域

本發明涉及一種改良L-15培養基及其在培養對蝦肌肉細胞中的應用。

背景技術

對蝦細胞系的建立是研究病毒致病機理、分離純化對蝦病毒、發展有效診斷試劑的基礎。對蝦細胞系的成功建立不僅可以精確控制實驗條件，還可以大大降低實驗成本，獲得更好的研究結果。培養基是培養細胞不可缺失的一部分，現有的培養基還不能滿足對蝦細胞建系，所以細胞培養基的優化是蝦細胞成功建系的關鍵之一，這對研究蝦細胞體外培養具有重要意義。

目前沒有專門針對對蝦的細胞培養基，對蝦細胞培養主要還是采用改良的哺乳動物或昆蟲細胞培養基，例如L-15、M199、RPMI、Grace等。其中L-15和M199培養基已證明能夠支持對蝦部分組織細胞的生長，比如卵巢細胞、性腺細胞等。肌肉占對蝦身體的大部分，研究肌肉細胞對對蝦的研究和發展具有重要意義。

中國發明專利CN103232969 B公開了一種對蝦細胞培養基的保存液，以1.5×L-15培養基為基礎培養基，并添加體積比為10％的對蝦肌肉提取液、5g/L氯化鈉、2g/L葡萄糖、1g/L碳酸氫鈉、10μg/mL牛磺酸、10μg/mL脯氨酸、100IU/mL青霉素鈉和100μg/mL硫酸鏈霉素；pH值為7.3-7.5。

然而，上述專利對細胞的氨基酸需求沒有精確測定，僅1.5倍擴大L-15培養基所有成分。并且，其原代細胞提取方法為組織塊培養，需培養幾個小時甚至幾天后才能得到細胞，且在培養過程中，組織塊培養法更容易受到污染。該專利的培養基工作液還加入了20ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和20ng/mL表皮生長因子(EGF)，大大增加了成本。

發明內容

本發明的目的在于提供一種改良L-15培養基及其在培養對蝦肌肉細胞中的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種改良L-15培養基，含有10mmol/L丙氨酸、3mmol/L甘氨酸、3mmol/L絲氨酸、1.5mmol/L組氨酸、0.5mmol/L賴氨酸、1.5mmol/L精氨酸、1.5mmol/L纈氨酸、1mmol/L蘇氨酸、0.5mmol/L蛋氨酸、0.5mmol/L亮氨酸、5mmol/L天冬氨酸、0.5mmol/L谷氨酰胺、1mmol/L苯丙氨酸，培養基其他原料的種類和濃度與L-15培養基相同；

所述的改良L-15培養基還含有2.5mmol/L?；撬帷?0mmol/L脯氨酸、20mmol/L谷氨酸、10％胎牛血清(FBS)、100IU/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素，pH值為7.2-7.4。

上述的改良L-15培養基可以用于培養對蝦肌肉細胞；

具體地，取上述的改良L-15培養基，加入培養基10％體積的對蝦肌肉細胞提取液，在27℃恒溫、5％CO₂中培養，每隔3d換一次培養基；

所述的更換培養基，是將培養體系離心(1000r/min離心5min)，取沉淀物，棄去培養基，加入新培養基；

所述的對蝦肌肉細胞提取液，由以下步驟制得：