[發明專利]一種CIK細胞庫的構建方法

在審

• 申請號: 202110367830.8
• 申請日: 2021-04-06
• 公開（公告）號: CN113445132A
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 王曉宇;李崴;郭康合;林冠妃;李秋宛
• 申請（專利權）人: 海南優尼科爾生物科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C12N5/0783;A01N1/02
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 葉似錦

1.一種CIK細胞庫的構建方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)采集人外周血；

2)分離自體血漿；

3)分離外周血單個核細胞；

4)擴增培養CIK細胞；

5)CIK細胞檢測；

6)CIK細胞凍存；

7)編碼入庫并上傳細胞信息檔案。

2.根據權利要求1所述的一種CIK細胞庫的構建方法，其特征在于：所述步驟1)中的采集人外周血是將人外周血采集至含枸櫞酸鈉抗凝劑的采血袋中。

3.根據權利要求2所述的一種CIK細胞庫的構建方法，其特征在于：所述步驟2)中的分離自體血漿的方法，包括如下步驟：

1)將采血袋中含枸櫞酸鈉抗凝劑的人外周血轉移至50ml離心管，利用離心機進行離心；

2)離心條件：4℃，1000-2800rpm離心5-20min，離心機調節升速1-9，降速1-9；

3)取上層淡黃色液體至新的50ml離心管，置于56℃水浴鍋中滅活30min后，3000-3500rpm離心3-8min收集上清得到自體血漿，置于-20℃凍存備用。

4.根據權利要求3所述的一種CIK細胞庫的構建方法，其特征在于：所述步驟3)中的分離外周血單個核細胞的方法，包括如下步驟：

1)將去除自體血漿后的下層紅色液體按照體積量計用生理鹽水對倍稀釋吹打混勻；

2)加入其0-2倍體積的0wt％-6wt％的羥乙基淀粉溶液，混勻后靜置0-40min，緩慢地將20-25ml紅色液體和/或上清液加入到含20ml淋巴細胞分離液的離心管中，使其與淋巴細胞分離液形成一個明顯的分層；

3)利用離心機進行離心分離，離心條件：4℃，1800-5000rpm離心10-30min，離心機調節升速1-3，降速1-3；

4)吸取底部紅細胞的上層所有液體并轉移至新的50ml離心管中；

5)利用離心機進行離心分離，離心條件：4℃，1500-3000rpm離心3-15min，離心機調節升速6-9，降速6-9；

6)棄上清，用40ml生理鹽水清洗細胞沉淀，取0.5ml細胞懸液用于細胞計數計算細胞回收率；

7)剩余細胞懸液利用離心機離心洗滌，離心條件：4℃，1500-3000rpm離心3-15min，離心機調節升速6-9，降速6-9，離心所得沉淀即為外周血單個核細胞。

5.根據權利要求4所述的一種CIK細胞庫的構建方法，其特征在于：所述步驟4)的擴增培養CIK細胞的方法，包括如下步驟：

1)將獲得的外周血單個核細胞接種于T175培養瓶中，補加GT-T551H3培養基，0-20％的自體血漿和終濃度為(500-1500)U/ml的IL-2、(100～1500)U/mL的IFN-γ以及(10～100)ng/mL抗CD3單克隆抗體使接種密度為1×10⁶個/ml，置于培養條件為溫度36.5～37.5℃、CO₂濃度4.5～5.5％、飽和濕度條件下培養，此天設為第0d；

2)CIK細胞培養第3d開始補加GT-T551培養基、IL-2及自體血漿，其中，IL-2和自體血漿的補加量按新補充培養體系的體積計算；

3)在培養第5、7、9、11d，充分吹打懸浮細胞，收集細胞計數，根據細胞數量再補充GT-T551培養基、IL-2及自體血漿，IL-2及自體血漿補加量按新補充的培養體系的體積計算，GT-T551培養基的使用量為3L，自體血漿全部用于補液；

4)培養第14d或細胞生長至100億后收集全部細胞并凍存。

6.根據權利要求5所述的一種CIK細胞庫的構建方法，其特征在于：所述步驟5)中CIK細胞檢測為在培養第12d，對CIK細胞進行支原體、細菌、內毒素、表型、細胞殺傷能力、細胞活性檢測。