[發明專利]一種經改造的螢光素酶突變體蛋白、生物發光探針、探針組、制備方法和檢測方法

有效

• 申請號: 202110367329.1
• 申請日: 2021-04-06
• 公開（公告）號: CN113025586B
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發明（設計）人: 倪維
• 申請（專利權）人: 湖北省中醫院
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/11;C12N1/21;C12Q1/6844;C12Q1/66;C12R1/19
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 張夢澤

本發明一種經改造的螢光素酶突變體蛋白、生物發光探針、探針組、制備方法和檢測方法，屬于分子生物學技術領域。本發明提供的一種經改造的螢光素酶突變體蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明提供的經改造的螢光素酶突變體蛋白是將螢光素酶蛋白166位點的半胱氨酸突變為絲氨酸，并在螢光素酶的C?末端添加半胱氨酸得到，通過對螢光素酶蛋白的改造實現了其與DNA分子的可控、等比例共價偶聯，從而構建了可對核酸產生響應的高信噪比生物發光探針，實現了對核酸分子的精確傳感，解決了生物發光傳感技術難以在核酸分子上進行應用的難題。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，尤其涉及一種經改造的螢光素酶突變體蛋白、生物發光探針、探針組、制備方法和檢測方法。

背景技術

MicroRNAs(miRNAs)是一類長度在22～25nt范圍內的小分子RNA，其不僅參與了細胞分化等重要的生物學過程，同時也是腫瘤等重大疾病的關鍵標志物分子。目前，已建立了基于電化學、熒光、化學發光等傳感原理的miRNAs檢測方法。然而，現有方法仍存在操作繁瑣、易受環境因素干擾、檢測設備成本較高的問題。

相對于傳統檢測技術，生物發光傳感具有信噪比高、光毒性小、不受外部激發光源和自熒光干擾的優勢，因此已在生物醫學分析領域得到了一定的應用。目前，生物發光傳感技術已成功應用于蛋白質、細胞等生物標志物的檢測，但是其在核酸標志物如microRNAs檢測中的應用仍十分有限。造成上述問題的主要原因在于：產生生物發光的螢光素酶無法直接對核酸含量和結構的變化產生實時、準確的響應。以上問題制約了生物發光在核酸標志物檢測中的應用。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種經改造的螢光素酶突變體蛋白、生物發光探針、探針組、制備方法和檢測方法。本發明提供的經改造的螢光素酶突變體蛋白能夠制備成基于DNA鏈置換的生物發光探針可實現對核酸分子的精確傳感，從而建立了一種針對miRNAs的高靈敏度、高準確性的檢測技術。

為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

本發明提供了一種經改造的螢光素酶突變體蛋白，所述經改造的螢光素酶突變體蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明提供了上述技術方案中所述的經改造的螢光素酶突變體蛋白的制備方法，包括如下步驟：將螢光素酶第166位點的半胱氨酸突變為絲氨酸，并在蛋白的C-末端添加含有半胱氨酸位點的連接區域，得到編碼經改造的螢光素酶突變體蛋白的DNA；將編碼經改造的螢光素酶突變體蛋白的DNA插入質粒載體中，得到重組質粒；將得到的重組質粒轉入大腸桿菌中，得到重組大腸桿菌；培養所述重組大腸桿菌，得到所述經改造的螢光素酶突變體蛋白。

優選的，所述質粒載體包括pET-25(b+)、pET-26(b+)、和pET-30(b+)中的一種。

優選的，所述大腸桿菌包括BL21(DE3)、BL21(DE3)pLyS、Rosetta(DE3)、和Origima(DE3)中的一種。

本發明提供了一種檢測核酸分子的生物發光探針，所述生物發光探針的制備用原料包括上述技術方案中所述的經改造的螢光素酶突變體蛋白和雙鏈DNA分子；

所述雙鏈DNA分子包括第一鏈和第二鏈兩條鏈，所述第一鏈的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述第二鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述第一鏈的5'端修飾有氨基基團，所述第二鏈的3'端修飾有發光猝滅基團Dabcyl。

本發明提供了上述技術方案中所述的生物發光探針的制備方法，包括如下步驟：將上述技術方案中所述的經改造的螢光素酶突變體蛋白與雙鏈DNA分子共價偶聯，得到所述生物發光探針。

優選的，所述共價偶聯的交聯劑包括SMCC。