[發明專利]一種經改造的螢光素酶突變體蛋白、生物發光探針、探針組、制備方法和檢測方法

有效

• 申請號: 202110367329.1
• 申請日: 2021-04-06
• 公開（公告）號: CN113025586B
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發明（設計）人: 倪維
• 申請（專利權）人: 湖北省中醫院
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N15/11;C12N1/21;C12Q1/6844;C12Q1/66;C12R1/19
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 張夢澤

1.一種經改造的螢光素酶突變體蛋白，其特征在于，所述經改造的螢光素酶突變體蛋

白的氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示。

2.權利要求1所述的經改造的螢光素酶突變體蛋白的制備方法，包括如下步驟：將螢光素酶第166位點的半胱氨酸突變為絲氨酸，并在螢光素酶的C-末端添加含有半胱氨酸位點的連接區域，得到編碼經改造的螢光素酶突變體蛋白的DNA，所述編碼經改造的螢光素酶突變體蛋白的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示；將編碼經改造的螢光素酶突變體蛋白的DNA插入質粒載體中，得到重組質粒；將得到的重組質粒轉入大腸桿菌中，得到重組大腸桿菌；培養所述重組大腸桿菌，得到所述經改造的螢光素酶突變體蛋白。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述質粒載體包括pET-25b(+)、pET-26b(+)和pET-30b(+)中的一種。

4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述大腸桿菌包括BL21(DE3)、BL21

(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)和Origami(DE3)中的一種。

5.一種檢測核酸分子的生物發光探針，其特征在于，所述生物發光探針的制備用原料

包括權利要求1所述的經改造的螢光素酶突變體蛋白和雙鏈DNA分子；

所述雙鏈DNA分子包括第一鏈和第二鏈兩條鏈，所述第一鏈的核苷酸序列如SEQ ID

NO.3所示，所述第二鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述第一鏈的5 '端修飾有氨基基團，所述第二鏈的3 '端修飾有發光猝滅基團Dabcyl。

6.權利要求5所述的生物發光探針的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：將權利要求1所述的經改造的螢光素酶突變體蛋白與雙鏈DNA分子共價偶聯，得到所述生物發光探針。

7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述共價偶聯的交聯劑包括SMCC。

8.檢測核酸分子的探針組，其特征在于，所述探針組包括權利要求5所述的生物發光探針和單鏈DNA探針；所述單鏈DNA探針包括觸發生物發光響應的序列和識別靶標核酸分子的序列，所述觸發生物發光響應的序列的核苷酸序列如SEQ ID NO .5。

9.一種檢測核酸分子的檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求8所述的探針組。

10.一種檢測核酸分子的檢測方法，其特征在于，將靶標核酸分子和單鏈DNA探針混合進行擴增，得到擴增產物；將擴增產物與權利要求5所述的生物發光探針共孵育，得到孵育后的產物；在得到的孵育后的產物中添加螢光素酶底物，通過酶標儀完成生物發光的檢測，實現靶標核酸分子的定量分析。