[發明專利]一種真菌菌種保存方法

有效

• 申請號: 202110366715.9
• 申請日: 2021-04-06
• 公開（公告）號: CN112899166B
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 尹良芬
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04
• 代理公司: 上海德悅知識產權代理事務所(普通合伙) 31344
• 代理人: 董黨紅

本發明提供一種真菌菌種保存方法，將干熱滅菌的變色硅膠顆粒和干燥的長滿真菌菌絲和/或真菌孢子的小濾紙片放入透明或半透明的無菌微量離心管或無菌指形管中，微量離心管或指形管使用封口膜封口，存放在透明或半透明的微量離心管冷凍盒中，放置于﹣20℃冰箱保存。使用本發明的方法保存真菌菌種，菌種存活率高，保存時間長，菌種的干燥狀態易于觀察。此外，在穩定的低溫干燥條件下，菌種處于休眠狀態，菌種的生物學特性不容易發生退化，從而能夠很好地保持菌種固有的性狀。而且，該保存方法還具有菌種不容易被污染、查找菌種方便、菌種取用方便、設備要求簡單、占用空間小、保存容量大、工作效率高、方便遠距離攜帶及郵寄等優點。

技術領域

本發明屬于微生物學技術領域，具體涉及真菌菌種的保存方法。

背景技術

真菌微生物學領域，無論是科研還是教學都離不開菌種。真菌菌種是生物學真菌研究工作正常運行的關鍵，菌種質量的高低決定著研究工作的成敗。為使自然界分離的優質菌種能夠保持原有的優良性狀，最大限度地發揮作用，就需要盡可能完好地保存菌種。好的菌種保存方法不僅能夠延長菌種的保存時間，還能夠防止菌種功能退化，有效地保持菌種的優良性狀。

真菌菌種的保存方法很多，各有優缺點。大體上可分為4類，即傳代法、干燥法、低溫干燥法及冷凍法。

傳代法，也叫定期移植法，是將真菌菌種移植到斜面培養基上，放置室溫或者放置4℃冰箱中保存。該方法操作簡便，適用廣泛，不需要特殊存儲設備，費用低。但缺點是傳代法中微生物的生長和代謝活動幾乎沒有受到抑制，因而保存時間較短，需要經常進行移植(三個月或者更短時間就需要移植一次)，繁瑣費時。傳代法最致命的缺點還是多次繼代培養后菌種的生物學特性容易退化，失去菌種原有的優良性狀。

干燥保存法，是將菌種干燥后放置在干燥室溫環境下進行保存的方法。通常的做法是利用5％的脫脂牛奶洗滌真菌孢子，配制成高濃度的孢子懸浮液后加在無菌硅膠上，室溫干燥后放在盛有硅膠的干燥器中進行保存。干燥保存法保存的菌種便于運輸，保存時間長。但干燥保存法適用范圍較窄，只能保存在培養基上產生孢子的真菌菌種，而且一直放置在干燥器中，保存容量有限。

低溫干燥保存法，是將需要保存的真菌孢子懸浮在保護劑如脫脂牛奶中，無菌分裝后置于冷凍液中，加干燥劑(如硅膠等)抽真空進行干燥，然后封口放低溫冰箱中保存。低溫干燥保存法保存的菌種存活率高、保存時間長、菌種穩定性高；但操作繁瑣，需專用設備，而且同樣只能保存產生孢子的菌種。

冷凍法保存，是將菌種保存于﹣80℃的超低溫冰箱，或者超低溫冷凍保存在液氮(﹣196℃)中，冷凍法保存的菌種保存時間長，菌種不易退化。但冷凍法操作復雜，需特殊設備，液氮還需要定期添加，費用高昂。

此外還有很多改進后的保存方法。如礦物油保存法，即傳代法利用培養基斜面保存菌種時，在培養基上面加一層滅菌石蠟油，加的量應該超過斜面頂部1cm，然后放置室溫保存或者放置冰箱中冷藏保存。礦物油保存法簡便，而且保存時間比較長，而且不需專用設備。有實驗證明，礦物油保存法保存的一種半知菌在保存45年后依然存活。但礦物油容易污染環境，占用空間大而且有異味，且礦物油保存法保存的菌種恢復時生長緩慢且外觀帶粘性，一般需要多移植1～2次才能恢復正常。

此外還有Richards保存法，是將菌種培養在Richards培養液中，然后收集孢子平攤在濾紙上，干燥24h后于4℃中冰箱保存。

此外還有濾紙低溫保存法。濾紙低溫保存法是將真菌孢子收集在濾紙上，或將濾紙放置在真菌菌落上讓孢子生長到濾紙上，或者將濾紙與菌種共培養，讓真菌菌絲和(或)孢子長到濾紙上，然后將濾紙干燥后放置于﹣20℃冰箱中保存。比較起來，濾紙低溫干燥保存菌種是最為經濟有效的方法。