[發(fā)明專利]一種DNA及其甲基化水平的檢測試劑盒和制備方法、應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110366210.2
• 申請日: 2021-04-06
• 公開（公告）號: CN113151403B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發(fā)明（設計）人: 鄒綱;楊珂昕
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12Q1/6825
• 分類號: C12Q1/6825;C12Q1/6827
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權代理有限公司 11227
• 代理人: 潘穎

本發(fā)明涉及DNA的檢測分析領域，特別涉及一種DNA及其甲基化水平的檢測試劑盒和制備方法、應用。該檢測試劑盒包括ssDNA1修飾的殼聚糖纖維、ssDNA2修飾的金納米粒子；ssDNA1為與目的DNA一端序列互補的ssDNA；ssDNA2為與目的DNA另一端序列互補的ssDNA；殼聚糖纖維為帶有熒光標記的殼聚糖纖維。本發(fā)明檢測方法對p16及其甲基化顯示了高的靈敏性和選擇性，檢測過程簡便、靈敏、快速，檢測結果準確，檢測手段簡單。

技術領域

本發(fā)明涉及DNA的檢測分析領域，特別涉及一種DNA及其甲基化水平的檢測試劑盒和制備方法、應用。

背景技術

DNA甲基化通常發(fā)生在CpG島上，是在DNA甲基化轉移酶的催化作用下，在胞嘧啶環(huán)的第五位碳上加入一個甲基化基團，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的過程。DNA甲基化在基因表達和調(diào)控、維持基因組穩(wěn)定性、X染色體失活和哺乳動物細胞方面扮演著重要角色。腫瘤抑制基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的變化可導致腫瘤抑制基因的轉錄沉默，因此被視為各種疾病和癌癥的標志。已經(jīng)開發(fā)了許多傳統(tǒng)的DNA甲基化檢測方法，但是這些方法都有一定的局限性，比如亞硫酸氫鹽的處理可能會由于氧化損傷導致DNA降解，這對于甲基化的檢測可能會產(chǎn)生誤導性的結果；HPLC和MS只能測量整體甲基胞嘧啶的含量，且需要大量輸入DNA和復雜儀器。

熒光檢測方法由于其靈敏度高、操作簡單，目前正在獲得越來越多的關注。然而，目前熒光傳感器具有一些特殊的局限性，如在復雜環(huán)境中穩(wěn)定性低、與背景熒光光譜相重疊等等。此前我們已經(jīng)開發(fā)了基于聚二乙炔微米管對miRNA-21進行檢測的光波導傳感器，但是其對于DNA甲基化檢測的應用尚未探究過。此外，合成聚二乙炔微米管的步驟繁瑣且成本高昂，因此開發(fā)一種新型的基于熒光的光波導傳感器對DNA甲基化進行高特異性和高靈敏度地檢測仍然是一項非常有挑戰(zhàn)性的任務。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種DNA及其甲基化水平的檢測試劑盒和制備方法、應用。本發(fā)明采用了殼聚糖天然高分子材料，本發(fā)明制備了一維殼聚糖纖維，并結合熒光共振能量轉移機制、DNA的三明治雜交、濃縮富集效應等，構筑了高靈敏度、高選擇性的新型生物傳感器用于p16等DNA及其甲基化的檢測。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：

本發(fā)明提供了一種DNA的檢測試劑盒，包括ssDNA1修飾的殼聚糖纖維、ssDNA2修飾的金納米粒子；ssDNA1為與目的DNA一端序列互補的ssDNA；ssDNA2為與目的DNA另一端序列互補的ssDNA；殼聚糖纖維為帶有熒光標記的殼聚糖纖維。

在本發(fā)明提供的具體實施例中，熒光標記為FITC。但熒光標記種類并非限定于此，本領域技術人員認可的種類均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

在本發(fā)明提供的具體實施例中，目的DNA為p16。但DNA的種類并非限定于此，本領域技術人員認可的種類均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明方法基于目標分子p16與ssDNA1、ssDNA2的雜交，形成三明治結構，通過ssDNA2修飾的金納米粒子，使殼聚糖纖維端頭光波導熒光信號淬滅。隨著濃縮富集反應，低濃度的p16就可產(chǎn)生高的信號，從而實現(xiàn)目標的檢測。該檢測方法對p16及其甲基化顯示了高的靈敏性和選擇性，檢測過程簡便、靈敏、快速，檢測結果準確。

本發(fā)明還提供了該檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

將殼聚糖、熒光素溶于溶劑中，得到殼聚糖溶液，濃縮，制成纖維；除去纖維表面的溶劑，干燥，表面修飾環(huán)氧基團，得到環(huán)氧修飾的殼聚糖纖維；氨基修飾的ssDNA1與環(huán)氧修飾的殼聚糖纖維發(fā)生反應，得到ssDNA1修飾的殼聚糖纖維；

將金納米粒子與巰基修飾的ssDNA2進行孵育，得到ssDNA2修飾的金納米粒子。

作為優(yōu)選，以g/mg/mL計，殼聚糖溶液中殼聚糖、熒光素與溶劑的比例為(0.5～5)：(1～10)：(10～50)。