[發(fā)明專利]一種指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)和CRISPR-Cas 12a結(jié)合的生物傳感器及其檢測方法和應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2021-04-06
• 公開（公告）號: CN113322306A
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李昺之;張幸;鎖緹瑩;吉峙潤;謝思盈
• 申請（專利權(quán)）人: 南京師范大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/6825
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

本發(fā)明公開了一種指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)和CRISPR?Cas 12a結(jié)合的生物傳感器及其檢測方法和應(yīng)用，該傳感器的DNA模板由兩段相同的序列，通過Nt.BstNI的酶切位點連接而成；其中，DNA模板的5’端復(fù)制出來的反義鏈，其臨近3’端附近可以與CRISPR?Cas12a的crRNA互補(bǔ)配對；當(dāng)樣品中含有Let?7a的序列，DNA模板與Let?7a序列互補(bǔ)成雙鏈，在聚合酶的作用下啟動整個體系的擴(kuò)增反應(yīng)，接著在Nt.BstNI的作用下，切割出能夠與CRISPR?Cas12a的crRNA互補(bǔ)的單鏈DNA，從而激活CRISPR?Cas12a的切割熒光團(tuán)標(biāo)記的單鏈DNA的能力；反之，若樣品中沒有Let?7a，則整個反應(yīng)不會發(fā)生。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物傳感器及其檢測方法和應(yīng)用，涉及一種指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)和CRISPR-Cas 12a相結(jié)合的生物傳感器及其檢測方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

microRNA，簡寫miRNA，是一類內(nèi)源性、非編碼的較短的RNA分子(19-23nt)。其可通過與目標(biāo)mRNA結(jié)合，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的抑制、mRNA的降解，在調(diào)控基因表達(dá)中扮演了重要的角色。它們在生物樣品中的穩(wěn)定性，對不利貯存環(huán)境的抵抗性等，使得其可作為一種生物標(biāo)記物。microRNA在廣泛的生物過程中發(fā)揮重要作用，包括增殖、發(fā)育、代謝、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生和病毒感染。為了更好地了解這些生物分子的功能，必須對其進(jìn)行檢測，這對于人類疾病的早期診斷以及通過使用這些分子作為靶點發(fā)現(xiàn)新藥具有巨大的潛力。RNA印跡技術(shù)被認(rèn)定為檢測microRNA的標(biāo)準(zhǔn)方法。但是該方法涉及到大量的人工操作，此外該方法耗時、耗量，非常不適合現(xiàn)場快速檢測。Let-7a作為一種microRNA，在腫瘤等疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。但是該microRNAs本身的含量很低。因此，需要開發(fā)出一種具有高靈敏性、高特異性、簡單、快速的檢測方法。

等溫酶擴(kuò)增技術(shù)利用獨特的DNA和RNA聚合酶，例如Phi29、Bst、Vent exo-DNA聚合酶以及T7 RNA聚合酶，最終可產(chǎn)生包含數(shù)十至數(shù)百個串聯(lián)重復(fù)序列的單鏈DNA或者RNA。這種強(qiáng)大的擴(kuò)增技術(shù)已成為生物醫(yī)學(xué)研究和納米生物技術(shù)中優(yōu)良的工具。等溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)(EXPAR)，是一種結(jié)合單鏈剪切和聚合酶延伸的等溫擴(kuò)增技術(shù)，這種技術(shù)具有很高的擴(kuò)增效率。其特點在于利用特殊的切刻內(nèi)切酶識別特異的堿基序列并且只剪切雙鏈DNA中的一條鏈，但是EXPAR的背景信號較強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的在于通過設(shè)計一種指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)和CRISPR-Cas 12a相結(jié)合的生物傳感器，從而放大檢測信號，以提高整個檢測方法的靈敏度與特異性。本發(fā)明設(shè)計的模板，包含兩個對稱的部位和一個缺口酶酶切位點，從而使得信號呈指數(shù)倍放大。本發(fā)明的另一個目的是提供該生物傳感器的檢測方法以及應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明所述的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)和CRISPR-Cas 12a相結(jié)合的生物傳感器，該傳感器的DNA模板由兩段相同的序列，通過Nt.BstNI的酶切位點連接而成；其中，DNA模板的5’端復(fù)制出來的反義鏈，其臨近3’端附近可以與CRISPR-Cas12a的crRNA互補(bǔ)配對；當(dāng)樣品中含有Let-7a的序列，DNA模板與Let-7a序列互補(bǔ)成雙鏈，在聚合酶的作用下啟動整個體系的擴(kuò)增反應(yīng)，在Nt.BstNI的作用下，切割出能夠與CRISPR-Cas12a的crRNA互補(bǔ)的單鏈DNA，從而激活CRISPR-Cas12a的切割熒光團(tuán)標(biāo)記的單鏈DNA的能力；反之，若樣品中沒有Let-7a，則整個反應(yīng)不發(fā)生。

所述的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)和CRISPR-Cas 12a相結(jié)合的生物傳感器，模板序列：5‘-AACTATAC AACC TACT ACCT CAAA CAGA CTC AAAC TATA CAAC CTAC TACC TCAA-3’；

Let-7a序列：5’-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’；

crRNA序列：5’-UAA UUU CUA CUA AGU GUA GAU AAC UAU ACA ACC UAC UAC CUCA-3’。