[發明專利]一種指數擴增反應和CRISPR-Cas 12a結合的生物傳感器及其檢測方法和應用

在審

• 申請號: 202110365781.4
• 申請日: 2021-04-06
• 公開（公告）號: CN113322306A
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發明（設計）人: 李昺之;張幸;鎖緹瑩;吉峙潤;謝思盈
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/6825
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

1.一種指數擴增反應和CRISPR-Cas 12a相結合的生物傳感器，其特征在于，該傳感器的DNA模板由兩段相同的序列通過Nt.BstNI的酶切位點連接而成；其中，DNA模板的5’端復制出來的反義鏈，其臨近3’端附近可以與CRISPR-Cas12a的crRNA互補配對；當樣品中含有Let-7a的序列，DNA模板與Let-7a序列互補成雙鏈，在聚合酶的作用下啟動整個體系的擴增反應，在Nt.BstNI的作用下，切割出能夠與CRISPR-Cas12a的crRNA互補的單鏈DNA，從而激活CRISPR-Cas12a的切割熒光團標記的單鏈DNA的能力；反之，若樣品中沒有Let-7a，則整個反應不發生。

2.根據權利要求1所述的指數擴增反應和CRISPR-Cas 12a相結合的生物傳感器，其特征在于，模板序列：5‘-AACT ATAC AACC TACT ACCT CAAA CAGA CTC AAAC TATA CAAC CTACTACC TCAA-3’；

Let-7a序列：5’-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3’；

crRNA序列：5’-UAA UUU CUA CUA AGU GUA GAU AAC UAU ACA ACC UAC UAC CUC A-3’。

3.一種如權利要求1所述的指數擴增反應和CRISPR-Cas 12a相結合的生物傳感器的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)加入樣品；目標物存在的情況下，在DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻內切酶的作用下將啟動整個擴增反正反應，以實現放大信號的目的；

(2)加入與模板互補的適配體，適配體和模板的5’端附近通過堿基互補配對結合；

(3)加入DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻內切酶，適配體將沿著模板進行擴增，得到可以激活CRISPR-Cas12a的DNA片段；由于Nt.BstNBI切刻內切酶的切割，將新擴增出的DNA片段從模板上脫落下來，這使得擴增結果呈現出指數級的擴增；

(4)在步驟(3)得到的產物中加入CRISPR-Cas12a、crRNA、熒光標記的單鏈DNA以及反應緩沖液3，使用酶標儀測量其熒光強度；

(5)使用Real-Time PCR方法對步驟(1)中的樣品進行檢測，驗證本發明的方法的準確性。

4.根據權利要求3所述的指數擴增反應和CRISPR-Cas 12a相結合的生物傳感器的檢測方法，其特征在于，步驟(3)DNA聚合酶是在反應緩沖液1中，其中含有Tris-HCl、(NH₄)₂SO₄、KCL、MgSO₄、X-100；步驟(3)Nt.BstNBI切刻內切酶是在反應緩沖液2中，其中含有NaCl、Tris-HCl、MgCl₂、BSA；步驟(4)中的反應緩沖液3含有NaCl、Tris-HCl、MgCl₂、BSA。

5.根據權利要求3所述的指數擴增反應和CRISPR-Cas 12a相結合的生物傳感器的檢測方法，其特征在于，步驟(3)中Nt.BstNBI切刻內切酶的反應混合液、模板以及含有目標物的溶液，在50-65℃的條件下，反應30-60min。

6.根據權利要求3所述的指數擴增反應和CRISPR-Cas 12a相結合的生物傳感器的檢測方法，其特征在于，步驟(3)中的含Let-7a樣品的濃度為0-100nM。

7.如權利要求1所述的指數擴增反應和CRISPR-Cas 12a相結合的生物傳感器在制備Let-7a診斷試劑中的應用。