[發明專利]一種定量檢測單個原生質體和液泡內Cd2+

有效

• 申請號: 202110365237.X
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113155794B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發明（設計）人: 滕躍;余安;李志帥;管文杰;鄒路易;顧文秀;郁紅艷
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種定量檢測單個原生質體和液泡內Cd²⁺的方法，屬于植物生理毒理技術領域。本發明所述定量檢測單個原生質體和液泡內Cd²⁺的方法，包括如下步驟：(1)在待測原生質體或者液泡懸液中加入Leadmium^TM Green AM探針溶液，孵育，洗凈，得到待測懸液；(2)將步驟(1)得到的待測懸液進行熒光圖像的拍攝，得到懸液中單個原生質體或者液泡的總熒光強度；(3)將步驟(2)得到的總熒光強度帶入原生質體或液泡的標準曲線中，得到單個待測原生質體或單個液泡中Cd²⁺的含量(質量)。利用本發明的方法可以精確檢測每一個龍葵葉片原生質體或液泡中Cd²⁺的含量，且準確率達到95％以上。

技術領域

本發明涉及一種定量檢測單個原生質體和液泡內Cd²⁺的方法，屬于植物生理毒理技術領域。

背景技術

超積累植物具有極高的重金屬積累水平，受到Cd脅迫的植物會有一系列的解毒機制來應對，以維持植物生理穩態。

目前，關于鎘吸收和轉運已經有從根到莖、葉，從組織到細胞和基因范圍的研究，主要集中在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、天藍歇菜(Thlaspi caerulescens)、東南景天(Sedum alfredii Hance)等Cd的超積累品種中。迄今為止的研究表明，重金屬Cd轉移到地上后會以一個不損害重要的細胞器和參與細胞生命活動的細胞溶質的方式儲存，也就是儲存在液泡中。這種解毒機制稱為液泡區室化，是超積累植物的一種重要的解毒機制。

然而目前對液泡區室化的過程了解并不透徹，因此，有必要從細胞甚至液泡水平更好地了解Cd的積累、運輸和內部反應，從而為植物液泡區室化對Cd吸收和植物維持體內穩態的貢獻提供見解。

發明內容

[技術問題]

目前關于植物中Cd的檢測都是檢測總的鎘含量，并未有文獻公開使用線性標準曲線定量檢測Cd²⁺，特別是單個原生質體中或者單個液泡中Cd²⁺的含量。

[技術方案]

為了解決上述至少一個問題，本發明采用了高選擇性、低檢出限的熒光探針Leadium^TM Green AM和Cd²⁺相結合，通過熒光強度和Cd²⁺含量的對應關系，實現了原生質體和液泡內 Cd²⁺的含量的檢測。這是對單個原生質體或液泡中Cd²⁺的定量方法的一大改進。

本發明的第一個目的是提供一種定量檢測單個原生質體和液泡內Cd²⁺的方法，包括如下步驟：

(1)在待測原生質體或者液泡懸液中加入Leadmium^TM Green AM探針溶液，孵育，洗凈，得到待測懸液；

(2)將步驟(1)得到的待測懸液進行熒光圖像的拍攝，得到懸液中單個原生質體或者液泡的總熒光強度；

(3)將步驟(2)得到的總熒光強度帶入原生質體或液泡的標準曲線中，得到單個待測原生質體或單個液泡中Cd²⁺的含量(質量)。

在本發明的一種實施方式中，步驟(1)中所述的待測原生質體或者液泡懸液和Leadmium^TM Green AM探針溶液的體積比為1～2mL：10μL，進一步優選為1.9mL：10μL。

在本發明的一種實施方式中，步驟(1)中所述的Leadmium^TM Green AM探針溶液的制備方法為：