[發(fā)明專利]一種定量檢測單個(gè)原生質(zhì)體和液泡內(nèi)Cd2+

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110365237.X
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113155794B
• 公開（公告）日: 2022-11-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 滕躍;余安;李志帥;管文杰;鄒路易;顧文秀;郁紅艷
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種定量檢測單個(gè)原生質(zhì)體和液泡內(nèi)Cd²⁺的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)在待測原生質(zhì)體或者液泡懸液中加入Leadmium^TMGreen AM探針溶液，孵育，洗凈，得到待測懸液；

(2)將步驟(1)得到的待測懸液進(jìn)行熒光圖像的拍攝，得到懸液中單個(gè)原生質(zhì)體或者液泡的總熒光強(qiáng)度；

(3)將步驟(2)得到的總熒光強(qiáng)度帶入原生質(zhì)體或液泡的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到單個(gè)待測原生質(zhì)體或單個(gè)液泡中Cd²⁺的含量；

其中，步驟(2)中所述進(jìn)行熒光圖像的拍攝具體為：

取步驟(1)的待測懸液在熒光顯微鏡明場下，在熒光顯微鏡488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長的通道下，放大400倍拍攝數(shù)張?jiān)|(zhì)體或液泡熒光圖像；之后使用ImageJ軟件處理測定熒光強(qiáng)度的圖像，得到單個(gè)原生質(zhì)體或者液泡的總熒光強(qiáng)度；

所述的用ImageJ軟件處理測定熒光強(qiáng)度具體為：

使用ImageJ軟件直線工具測量拍攝的顯微鏡測微尺上100μm真實(shí)長度顯示在顯微鏡圖像上的長度，獲得兩者的比例值，將比例值輸入到每一張顯微鏡圖像中，獲得顯微鏡圖像的真實(shí)面積；使用ImageJ軟件橢圓工具圈出每一個(gè)原生質(zhì)體或液泡獲取平均熒光強(qiáng)度，扣除該圖像的背景平均熒光強(qiáng)度，得到單個(gè)原生質(zhì)體或液泡的總熒光強(qiáng)度；

步驟(3)中所述的原生質(zhì)體或液泡的標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建方法為：

將不同濃度的CdCl₂溶液加入到原生質(zhì)體或液泡懸液中，使混合液中Cd²⁺的最終濃度為5、10、20、30、50μmol/L；之后向每個(gè)混合液中加入10μL的LeadmiumTM Green AM探針溶液，在黑暗、25℃孵育2h，洗凈后，得到懸液；

之后取部分懸液用于拍攝熒光圖像，每次制作玻片標(biāo)本取樣12μL；將得到的熒光圖像使用ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析，以50個(gè)原生質(zhì)體或液泡作為一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，數(shù)據(jù)點(diǎn)和誤差棒分別表示50個(gè)原生質(zhì)體或液泡的總熒光強(qiáng)度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差SE；

再取懸液3次，每次拍攝圖像5張，計(jì)算15張圖片上原生質(zhì)體或液泡的平均數(shù)量，依據(jù)圖片的真實(shí)面積估算出單位體積懸液中原生質(zhì)體或液泡的數(shù)量；其中每次采集的液體量和蓋玻片的尺寸都是恒定的，控制每個(gè)顯微鏡圖像中懸液的體積相同，以保證計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；

同時(shí)，剩余的含有不同濃度的Cd²⁺的懸液通過8μm的濾膜過濾，然后用洗滌液輕輕沖洗原生質(zhì)體或液泡三次，以去除各自表面的Cd²⁺；之后用15mL水沖洗濾膜上的原生質(zhì)體和液泡，使其遇水破裂釋放出吸收的Cd²⁺，然后用0.45μm濾膜過濾除去殘?jiān)脽晒怙@微鏡-原子吸收分光光度計(jì)AAS測定濾液中Cd²⁺的質(zhì)量濃度；

以ImageJ軟件獲得的相應(yīng)原生質(zhì)體或液泡數(shù)量為基礎(chǔ)，將熒光顯微鏡-原子吸收分光光度計(jì)檢測計(jì)算出的原生質(zhì)體和液泡懸液中Cd²⁺的質(zhì)量平均到每一個(gè)原生質(zhì)體或液泡上，得到單個(gè)原生質(zhì)體或者液泡的Cd²⁺含量和相應(yīng)的總熒光強(qiáng)度，根據(jù)兩者線性關(guān)系得到原生質(zhì)體或液泡的Cd²⁺的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的待測原生質(zhì)體或者液泡懸液和Leadmium^TMGreen AM探針溶液的體積比為1～2mL：10μL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的孵育是20～30℃下避光孵育2h。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述待測原生質(zhì)體或者液泡懸液是龍葵的原生質(zhì)體或者液泡懸液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的原生質(zhì)體的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝11298x+2773.9，R²＝0.9953；液泡的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝33112x+351.87，R²＝0.9799；其中y是總的熒光強(qiáng)度，x是Cd²⁺的含量。