[發(fā)明專利]原核Argonaute蛋白的基因編輯應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110365085.3
• 申請(qǐng)日: 2021-04-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112941107A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張智英;邢佳妮;麻麗霞;閆強(qiáng);李鵬程;徐坤;程心珍;閆娜娜;孫永森;李倩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/55;C12N15/113
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 61200
• 代理人: 范巍

本發(fā)明公開(kāi)了一種原核Argonaute蛋白的基因編輯應(yīng)用，通過(guò)構(gòu)建源于細(xì)菌的Argonaute蛋白的原核表達(dá)載體，以及在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后對(duì)該Argonaute蛋白的表達(dá)載體和共轉(zhuǎn)化載體的降解的檢測(cè)以及基因組位點(diǎn)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了其具有被特異性轉(zhuǎn)錄本激活并靶向特定DNA靶序列的能力，并且在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的導(dǎo)向RNA的參與下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因組靶序列進(jìn)行inDel頻率為3％的基因編輯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明原核Argonaute蛋白可以用于細(xì)胞內(nèi)基因編輯工具的開(kāi)發(fā)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及原核Argonaute(pAgo)蛋白的核酸酶特性以及通過(guò)其實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)基因編輯工具的開(kāi)發(fā)。

背景技術(shù)

基因編輯技術(shù)通常使用的基因編輯工具包括ZFNs(Kim,Skowron,zybalski 1996；Bitinaite et al.1998)和TALENs(Cermak et al.2011)，以及CRISPR/Cas9(Bikard etal.2012)。CRISPR/Cas9技術(shù)通過(guò)使用人工核酸酶對(duì)基因組DNA的目標(biāo)位置引入雙鏈斷裂(Double strand breaks,DSBs)，利用細(xì)胞自身的修復(fù)途徑，例如非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)，以及同源序列介導(dǎo)的同源重組(homologousrecombination,HR)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因序列的修改，能夠比較精確的對(duì)生物體基因組特定目標(biāo)基因位點(diǎn)進(jìn)行修飾。但是CRISPR/Cas9技術(shù)也有一定缺陷，那就是對(duì)PAM序列的依賴(Garneau et al.2010)以及具有一定脫靶性(Zhang et al.2015)。對(duì)PAM序列的依賴使其在靶基因序列的選擇上受到限制，脫靶性也造成了其在基因疾病治療等領(lǐng)域應(yīng)用時(shí)的潛在威脅。因此，開(kāi)發(fā)出其他種類的基因編輯工具成為基因工程領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

原核Argonaute蛋白是細(xì)胞防御外源DNA入侵或者病毒感染的工具之一，具有降解外源DNA的能力，這一能力的發(fā)現(xiàn)始于荷蘭瓦赫寧根大學(xué)的John van der Oost團(tuán)隊(duì)領(lǐng)銜發(fā)表的關(guān)于TtAgo作為一種以5'磷酸化的單鏈DNA(ssDNA)為導(dǎo)向序列的靶向切割互補(bǔ)的單鏈DNA序列的核酸酶(Swarts et al.2014)的研究報(bào)道。由于大多數(shù)原核Argonaute蛋白(pAgos)宿主菌的生存條件都較為極端，例如高熱以及高鹽，這就使得在宿主菌中研究其蛋白活性及其生理功能較為困難。

隨著越來(lái)越多的關(guān)于古細(xì)菌、細(xì)菌的Argonaute蛋白與導(dǎo)向序列和靶序列在細(xì)胞外環(huán)境下共同孵育的實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，證明了原核Argonaute蛋白的核酸切割活性。其中大多數(shù)原核Argonaute蛋白以DNA為酶作用底物(TtAgo(Swarts et al.2014)、PfAgo(Swarts etal.2015)、MpAgo(Doxzen and Doudna 2017；Kaya et al.2016)、MjAgo(Zander etal.2017)、CbAgo(Hegge et al.2019；Kuzmenko et al.2020)、RsAgo(Miyoshi etal.2016))，個(gè)別原核Argonaute蛋白也可以以RNA為酶作用底物(NgAgo(Qi et al.2016；Wuet al.2017)、RsAgo(Olovnikov et al.2013))；不同原核Argonaute蛋白的導(dǎo)向序列也不完全相同，有些需要導(dǎo)向序列的DNA 5'磷酸化修飾(TtAgo(Swarts et al.2014)、PfAgo(Swarts et al.2015)、MjAgo(Zander et al.2017)、CbAgo(Hegge et al.2019)、NgAgo(Qiet al.2016))，有些需要識(shí)別5'羥基化的DNA導(dǎo)向序列(MpAgo(Kaya et al.2016))。