[發(fā)明專利]一種珊瑚致病菌的益生菌篩選及防治方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110363449.4
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN113425858A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇宏飛;張琦;余克服;王英輝;陸春蓉;黃沁愉;蔣學(xué)建;陳凡;秦曉;謝如楓;任天飛
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號: A61K49/00
• 分類號: A61K49/00;A61K35/741;A61P31/04;C12Q1/04;C12Q1/18
• 代理公司: 南寧智卓專利代理事務(wù)所(普通合伙) 45129
• 代理人: 鄧世江

1.一種珊瑚致病菌的潛在益生菌篩選方法，其特征在于，該篩選方法包括如下步驟：

(a1)樣本選擇：采集生長狀態(tài)良好的健康珊瑚，置于養(yǎng)殖池中適應(yīng)至少15d；

(a2)菌株培養(yǎng)：將待篩選菌株和目標(biāo)菌株分別接種于液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，測定菌株的OD₆₀₀值并制作其生長曲線；

(a3)拮抗實(shí)驗(yàn)：將備好的無菌干凈的藥敏紙片置于待篩選菌株的培養(yǎng)基中，將目標(biāo)致病菌涂布于MA平板上，再將沾有篩選菌株的藥敏紙片置于已涂布有目標(biāo)致病菌的MA平板上，將平板置于29℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察拍照。

(a4)菌株鑒定：當(dāng)MA平板上藥敏紙片周圍出現(xiàn)明顯抑菌圈時(shí)，將對應(yīng)的篩選的潛在益生菌菌株進(jìn)行PCR，16srDNA測序，鑒定其種屬，選取其中一種作為目標(biāo)潛在益生菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種珊瑚致病菌的潛在益生菌篩選及防治方法，其特征在于，所述目標(biāo)菌株為致病菌Vibrio coralliilyticus的菌株，該致病菌保藏于海洋微生物菌種保藏管中心，保藏編號為MCCC1A00545。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種珊瑚致病菌的潛在益生菌篩選及防治方法，其特征在于，所述珊瑚為鹿角杯形珊瑚。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種珊瑚致病菌的潛在益生菌篩選及防治方法，其特征在于，步驟(b2)中，若空白組和陰性對照組的珊瑚樣本狀態(tài)優(yōu)于陽性對照組，且實(shí)驗(yàn)組1或?qū)嶒?yàn)組2的珊瑚樣本狀態(tài)優(yōu)于陽性對照組，且檢測數(shù)據(jù)存在顯著性差異，表明對珊瑚致病菌防治有效。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種珊瑚致病菌的潛在益生菌篩選及防治方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基為MA液體培養(yǎng)基。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種珊瑚致病菌的潛在益生菌篩選及防治方法，其特征在于，步驟(b1)中的5組處理，每組處理設(shè)有至少3個(gè)重復(fù)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種珊瑚致病菌的潛在益生菌篩選及防治方法，其特征在于，所述的潛在益生菌為GXUZ9。

8.一種珊瑚致病菌的潛在益生菌防治方法，其特征在于，該防治方法包括如下步驟：

(b1)菌株培養(yǎng)：將已篩選的目標(biāo)潛在益生菌(GXUZ9)與目標(biāo)致病菌分別加入到MA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至平穩(wěn)期；

(b2)分組處理：將珊瑚株分為五組，每組三株，處理如下：單獨(dú)添加有海水，作為空白組，單獨(dú)添加有致病菌，作為陽性對照組，單獨(dú)添加有潛在益生菌，作為陰性對照組，同時(shí)加致病菌與潛在益生菌作為實(shí)驗(yàn)組1，提前五小時(shí)加潛在益生菌后加致病菌作為實(shí)驗(yàn)組2；

(b3)接種觀察：將步驟(b1)的5組的單個(gè)珊瑚樣本分別進(jìn)行接種處理，期間測定珊瑚樣本上的共生蟲黃藻密度及光合效率，并觀察記錄珊瑚樣本表觀特征；

(b4)防治評估：以步驟(b2)各珊瑚樣本表觀特征，共生蟲黃藻密度，光合速率判斷致病菌作用珊瑚樣本前后差異為指標(biāo)，評估珊瑚樣本在致病菌作用前后白化程度，若空白組和陰性對照組的珊瑚樣本狀態(tài)優(yōu)于陽性對照組，且實(shí)驗(yàn)組1或?qū)嶒?yàn)組2的珊瑚樣本狀態(tài)優(yōu)于陽性對照組，則表明潛在益生菌對目標(biāo)致病菌導(dǎo)致的珊瑚疾病防治有效。