[發(fā)明專利]一種固定化酶及其制備方法與在OPO制備中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110362057.6
• 申請(qǐng)日: 2021-04-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113174384B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-02-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃雪;楊銳釗;馮光炷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N9/20
• 分類號(hào): C12N9/20;C12N11/14;C12N11/02;C12P7/6458
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

本發(fā)明公開(kāi)了一種固定化酶及其制備方法與在制備OPO中的應(yīng)用。本發(fā)明所述固定化酶的制備方法包括如下步驟：將磁性載體和脂肪酶分散在磷酸緩沖液中形成反應(yīng)液，將反應(yīng)液在20～60℃下反應(yīng)1～6h，得到所述固定化酶；所述磁性載體為多巴胺修飾的鐵酸鋅。本發(fā)明將鐵酸鋅磁性顆粒作為磁性核心，利用多巴胺對(duì)鐵酸鋅表面進(jìn)行修飾得到所述磁性載體，通過(guò)共價(jià)結(jié)合將脂肪酶固定在磁性載體表面，得到固定化酶，并將其用于催化合成OPO中，OPO的轉(zhuǎn)化率可高達(dá)38％。本發(fā)明所述固定化酶，具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，良好的催化能力，改善了脂肪酶的熱穩(wěn)定性，對(duì)嬰兒配方奶粉中添加劑的合成起到重要作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶固定化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種固定化酶及其制備方法與在制備OPO中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

酶是催化生物和化學(xué)反應(yīng)的一種蛋白質(zhì)，具有催化活性高、選擇性強(qiáng)、專一性好、成本低、反應(yīng)條件溫和以及可被生物降解等優(yōu)點(diǎn)。因此酶在精細(xì)化學(xué)、藥物化學(xué)、食品或能源等各個(gè)領(lǐng)域都有很高的應(yīng)用。生物催化過(guò)程作為一種合理、高效的轉(zhuǎn)化方法受到了廣泛的關(guān)注。酶促工藝在支持可持續(xù)綠色化工中的發(fā)揮了重要作用。然而，天然酶在實(shí)際應(yīng)用中普遍操作和儲(chǔ)存穩(wěn)定性較差、酶的回收和重復(fù)利用困難、成本高，而且還會(huì)受到反應(yīng)液的影響。因此，固定化在酶催化中是常用的改善方法。

在實(shí)際應(yīng)用中，固定化酶在穩(wěn)定性、生物催化劑負(fù)載、可回收性等方面具有優(yōu)勢(shì)。固定化是成功實(shí)現(xiàn)以酶為基礎(chǔ)的工業(yè)過(guò)程的關(guān)鍵技術(shù)，特別是用于生產(chǎn)綠色和可持續(xù)能源或生物衍生的催化轉(zhuǎn)化化學(xué)品(工業(yè)化)。酶的固定化可以改變酶的活性、特異性或選擇性，這為增加酶在底物上的可用性提供了一個(gè)良好的基礎(chǔ)。如今，多巴胺仿生修飾磁性納米材料已經(jīng)被開(kāi)發(fā)為制備酶固定化載體的便捷方法了。

磁性納米材料主要是因?yàn)槠渚哂斜缺砻娣e，而且能通過(guò)外加磁場(chǎng)輕易地回收重復(fù)使用，從而優(yōu)化了操作成本，提高了產(chǎn)品的純度。磁性納米材料通常不會(huì)直接用作酶的固定化載體，會(huì)與其他一些材料，如高分子聚合物、介孔硅、氧化石墨烯等材料，形成不同的磁性復(fù)合材料，以此作為固定化載體。Mosayebi等以辛基官能化的磁性氧化石墨烯納米復(fù)合材料(GO-Fe₃O₄)為載體，對(duì)VII型念珠菌脂肪酶(CRL7)進(jìn)行固定化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相對(duì)于游離酶(34.5U·mg-1脂肪酶)，固定在此載體上的脂肪酶具有94.7％的酶活保留率，酯交換反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為89％，在10個(gè)循環(huán)后保留的活性為63％。Zhou等研究合成一種簡(jiǎn)單的核殼磁性COF復(fù)合材料(Fe₃O₄@COF-OME)，以其為載體對(duì)RML(根莖脂肪酶)進(jìn)行固載，應(yīng)用在生物柴油生產(chǎn)中。結(jié)果表明，該方法合成載體材料具有外在的磁性，能很好地分散在水介質(zhì)中，并能促進(jìn)脂肪酶的附著。Fe₃O₄@COF-OME磁性核殼結(jié)構(gòu)不僅很大程度上保持了脂肪酶的活性，而且具有較高的固定化效果和回收利用效果。在優(yōu)化條件下以麻瘋樹(shù)油為原料，生物柴油的轉(zhuǎn)化率約為70％。

多巴胺(DA)是一種典型的兒茶酚胺類有機(jī)化合物，其結(jié)構(gòu)與貽貝蛋白的基本粘附成分相似，可以作為材料表面改性劑。DA可以在堿性條件下(pH7.5)以氧氣為氧化劑自聚成聚多巴胺(PDA)，從而在幾乎所有有機(jī)和無(wú)機(jī)材料表面上形成具有可控制的厚度和良好粘合性能的納米級(jí)PDA膜，使其成為一種多功能的涂料。而且，PDA的化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在許多官能團(tuán)(例如胺，亞胺和鄰苯二酚)，使其很容易通過(guò)與官能團(tuán)的共價(jià)鍵合而將生物大分子固載在其表面。多巴胺幾乎可以充當(dāng)所有有機(jī)、無(wú)機(jī)材料的表面改性劑，因而在修飾功能化酶載體方面具有廣泛的應(yīng)用。多巴胺修飾載體材料后可以通過(guò)溫和的條件、簡(jiǎn)單步驟將酶固定起來(lái)。Ariaeenejad等用磁鐵礦納米顆粒和多巴胺對(duì)纖維素納米晶(CNCs)進(jìn)行功能化，制備出用于共價(jià)結(jié)合固定化水解酶混合物(三種纖維素酶，兩種半纖維素酶及其組合)的納米載體(DA/Fe₃O₄ NPs@CNCs)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該固定化酶具有更高的最佳溫度更高的熱穩(wěn)定性，以及最佳pH向堿性的轉(zhuǎn)變。共價(jià)結(jié)合可以成功抑制酶的浸出，并提供多達(dá)10個(gè)循環(huán)后仍能輕松回收再利用，初始活性可達(dá)50％以上。