[發明專利]一步法熒光檢測體系及DNA糖基化酶活性的檢測方法和應用

有效

• 申請號: 202110361586.4
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN113151420B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 張春陽;胡娟;劉雯
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/34
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王磊

本發明公開了一步法熒光檢測體系及DNA糖基化酶活性的檢測方法和應用，包括底物、模板、APE1酶、DNA聚合酶、dNTP/dUTP混合物、UDG酶和熒光染料，底物和模板均為單鏈DNA，底物含有8?氧鳥嘌呤，底物的3’端用NH₂修飾；模板由至少一條DNA1和至少一條DNA2交錯連接形成，DNA1與DNA2中均不含腺嘌呤，DNA1與DNA2的連接處含有腺嘌呤脫氧核苷酸；底物與DNA1、一部分DNA2互補，與8?氧鳥嘌呤互補的胞嘧啶位于DNA1；dNTP中不含dTTP。該檢測體系能簡單快速的完成檢測；能夠進行指數放大反應，提高了hOGG1檢測的靈敏度；避免了切刻內切酶的使用，從而有效防止非特異性擴增。

技術領域

本發明屬于分析檢查技術領域，涉及一步法熒光檢測體系及DNA糖基化酶活性的檢測方法和應用。

背景技術

公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

人類8-羥基鳥嘌呤DNA糖基化酶1(hOGG1)是細胞核和線粒體中一種重要的糖基化酶，作用于與胞嘧啶配對的8-氧鳥嘌呤(8-oxoG)，啟動所有生物體中氧化鳥嘌呤堿基的切除修復過程。hOGG1水平的異常與各種疾病有關，因此準確簡便的檢測hOGG1的活性在疾病的預測和診斷方面具有重要意義。

據發明人研究了解，近年來，等溫指數擴增反應(EXPAR)因其操作簡單、反應快、放大效率高而成為一種很有前途的分子診斷技術。在經典的EXPAR實驗中，切刻內切酶通常用于循環切割磷酸二酯鍵，使切刻位點的3’端作為引物不斷地啟動新一輪復制。然而在EXPAR分析中使用切刻內切酶容易引起不必要的非特異性擴增，這限制了實際應用中檢測的可靠性和特異性。另外增加切刻內切酶的數量還會降低EXPAR的反應速率。

發明內容

為了解決現有技術的不足，本發明的目的是提供一步法熒光檢測體系及DNA糖基化酶活性的檢測方法和應用，該檢測體系能更簡單快速的完成檢測；能夠進行指數放大反應，提高了hOGG1檢測的靈敏度；避免了切刻內切酶的使用，從而有效防止在傳統EXPAR系統中觀察到的非特異性擴增。

為了實現上述目的，本發明的技術方案為：

一方面，一種一步法熒光檢測體系，包括，

底物和模板：底物和模板均為單鏈DNA，底物含有8-氧鳥嘌呤，底物的3’端用NH₂修飾；模板由至少一條DNA1和至少一條DNA2交錯連接形成，DNA1與DNA2中均不含腺嘌呤，DNA1與DNA2的連接處含有腺嘌呤脫氧核苷酸；底物與DNA1、一部分DNA2互補，與8-氧鳥嘌呤互補的胞嘧啶位于DNA1；

APE1酶：用于切割AP位點；

DNA聚合酶和dNTP/dUTP混合物：用于在切除AP位點后3’OH端進行延伸反應，dNTP中不含dTTP；

UDG酶：用于清除延伸反應獲得延伸產物中的尿嘧啶；

熒光染料：用于與擴增產物產生熒光。

本發明中，底物的3’端用NH₂修飾用于防止非特異性擴增。底物含有8-氧鳥嘌呤，且與8-氧鳥嘌呤互補的胞嘧啶位于DNA1，能夠使hOGG1在特定位置識別并切除8-氧鳥嘌呤產生AP位點，通過APE1酶切割產生3’OH端，然后通過DNA聚合酶和dNTP/dUTP混合物進行延伸反應，由于連接處的腺嘌呤脫氧核苷酸，使得尿嘧啶核苷酸摻入延伸產物中，再通過UDG酶識別并切除尿嘧啶，然后通過APE1酶切割產生3’OH端，從而進行擴增，通過熒光染料能夠檢測到擴增產物，從而實現對hOGG1活性的檢測。