[發明專利]一步法熒光檢測體系及DNA糖基化酶活性的檢測方法和應用

有效

• 申請號: 202110361586.4
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN113151420B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發明（設計）人: 張春陽;胡娟;劉雯
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/34
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王磊

1.一種一步法熒光檢測體系，其特征是，包括，

底物和模板：底物和模板均為單鏈DNA，底物含有8-氧鳥嘌呤，底物的3’端用NH₂修飾；模板由至少一條DNA1和至少一條DNA2交錯連接形成，DNA1與DNA2中均不含腺嘌呤，DNA1與DNA2的連接處含有腺嘌呤脫氧核苷酸；底物與DNA1、一部分DNA2互補，與8-氧鳥嘌呤互補的胞嘧啶位于DNA1；

所述底物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

APE1酶：用于切割AP位點；

DNA聚合酶和dNTP/dUTP混合物：用于在切除AP位點后3’OH端進行延伸反應，dNTP中不含dTTP；

UDG酶：用于清除延伸反應獲得延伸產物中的尿嘧啶；

熒光染料：用于與擴增產物產生熒光。

2.如權利要求1所述的一步法熒光檢測體系，其特征是，所述DNA聚合酶為Klenow大片段聚合酶；

或，熒光染料為SYBR Green II。

3.如權利要求1所述的一步法熒光檢測體系，其特征是，底物的濃度為10nM時，模板的濃度為14～16nM；

或，底物的量為2×10^-4nmol時，APE1酶的用量為0.75～0.85U；

或，底物的量為2×10^-4nmol時，UDG酶的用量不低于2U；

或，底物的量為2×10^-4nmol時，Klenow大片段聚合酶的用量為1.9～2.1U；

或，底物的濃度為10nM時，dNTP/dUTP混合物的濃度為58～62μM。

4.如權利要求3所述的一步法熒光檢測體系，其特征是，所述UDG酶的用量為2.0～2.2U。

5.一種DNA糖基化酶活性的檢測試劑盒，其特征是，包括權利要求1～4任一所述的一步法熒光檢測體系、緩沖溶液。

6.一種權利要求1～4任一所述的一步法熒光檢測體系在篩選hOGG1抑制劑中的應用。

7.一種權利要求1～4任一所述的一步法熒光檢測體系在制備檢測癌細胞試劑中的應用。

8.如權利要求7所述的應用，其特征是，所述癌細胞為A549細胞和/或HeLa細胞。