[發明專利]對乙醇不敏感對正丁醇特異性響應的BmoR蛋白突變體

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• 申請號: 202110361553.X
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN115181168A
• 公開（公告）日: 2022-10-14
• 發明（設計）人: 霍毅欣;陳振婭;毋彤
• 申請（專利權）人: 北京理工大學
• 主分類號: C07K14/21
• 分類號: C07K14/21;C12N15/31;C12N15/70;C12N15/65;C12N1/21;C12Q1/6897;C12Q1/02;C12Q1/04;C12R1/19
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種對正丁醇特異性響應的BmoR蛋白突變體，及其在正丁醇檢測或生物傳感器中的應用。所述BmoR蛋白突變體是在序列表SEQ ID NO.1所示的野生型BmoR蛋白的基礎上發生W21R和/或E54V突變獲得的。上述突變體僅對正丁醇敏感，對乙醇或異丁醇無響應，解決了野生型BmoR蛋白無法區分正丁醇和異丁醇的問題；同時對正丁醇的檢測范圍達到0?100mM，提高了BmoR蛋白對正丁醇的響應飽和度，可用于更高產量菌株的篩選和應用。

技術領域：

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種對乙醇高度不敏感對正丁醇特異性響應的BmoR蛋白突變體，及其在正丁醇檢測或生物傳感器中的應用。

背景技術：

微生物合成的正丁醇是重要的運輸燃料，通過代謝工程合成正丁醇在許多微生物宿主中實現，而改造宿主菌株并篩選出高產宿主是實現醇工業化生產的基礎和關鍵。

乙醇是一種可再生的生物燃料，由多種生物質材料制成。燃料乙醇原料包括淀粉和糖含量高的谷物和農作物，例如玉米，高粱，大麥，甘蔗和甜菜。乙醇也可以由草，樹，農林業殘留物(例如玉米芯和木料，稻草，鋸末和木屑)制成。目前，生物乙醇用作公路運輸車輛汽油替代品的主要燃料，主要通過糖發酵工藝生產。在目前的能源不安全狀況和化石對環境安全的挑戰中，生物乙醇已發展成為生物燃料生產的潛在來源。對于生物乙醇生產，已經對廣泛的生物質資源進行了研究和實驗。但在乙醇的生產途徑中，伴隨著乙醇的大量生產，各種高級醇如正丁醇、異丁醇或異戊醇的產量也在提高。同時，若在乙醇酒精中高級醇含量過多，會大大損壞酒體的口味，味苦澀，且還帶有臭味。而且酒中高級醇過多會使人頭疼，飲用后易上頭，易喝醉。高級醇在水中的溶解度較小，在白酒降度中隨著乙醇濃度的減小其溶解度也將減小，這就給白酒降度帶來了一定的困難。因此實現對眾多副產物的識別篩選顯得尤為重要。

生物傳感器能夠特異性響應目標化合物從而輸出便于檢測的蛋白信號，因而已經被廣泛應用于高通量篩選。

生物傳感器由分子識別元件和信號轉換器組成。當分子識別元件與被測物體結合時，所產生的信號可以通過轉換器轉換為光信號或電信號，可對被測物進行檢測和分析。作為一種合成生物學新興工具，可以通過設計構建生物傳感器來動態的響應信號分子濃度的變化。與此同時，生物傳感器的設計是為了促進微生物細胞工廠的優化和生產一系列廣泛應用于工業的天然產品，如衣康酸、脂肪酸、異丁醇、正丁醇和生物堿。生物傳感器主要包括RNA核酸開關、轉錄因子調控的生物傳感器、G蛋白偶聯受體以及熒光蛋白生物傳感器。而熒光蛋白生物傳感器的低動態范圍、RNA核酸開關難以在體外進行、G蛋白偶聯受體僅能在胞外進行等弊端阻礙了生物傳感器在生物界的發展。

基于轉錄因子(TF)的生物傳感器應用最為廣泛。最常用的轉錄因子是細菌轉錄因子，包括配體結合結構域(LBD)或代謝結合結構域(MBD)和DNA結合結構域(DBD)。BmoR是假單胞菌正鏈烷烴代謝途徑的轉錄因子，是bEBP的成員，用于調節烷烴單加氧酶的σ⁵⁴依賴型啟動子P_bmo，信號分子是C2-C5的直鏈或支鏈醇。但野生型轉錄因子BmoR存在響應特異性差，對底物正丁醇和異丁醇均會產生響應，無法對其中一種醇進行特異響應，從而滿足工業需求；以及檢測范圍窄(0-40mM)等問題，無法廣泛應用于生物傳感器中。因此實現對醇的特異響應成并提高檢測范圍成為亟待解決的問題。

本發明通過蛋白質改造得到的BmoR蛋白突變體，不僅實現了對乙醇的高度不敏感，還可以對正丁醇產生特異響應，同時提高了其底物檢測上限，為高效檢測正丁醇和快速篩選高產菌株提供了一種解決方案。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種對正丁醇能產生特異性響應，但對乙醇或異丁醇不敏感的BmoR蛋白及生物傳感器，通過引入蛋白質工程方法對野生型BmoR 的N端進行修飾，利用易錯PCR技術構建隨機突變文庫；通過外源添加乙醇，正丁醇和異丁醇，對突變庫進行篩選分析，最終得到了對乙醇或異丁醇高度不敏感且對正丁醇特異性響應的BmoR突變體蛋白。