[發明專利]一種莖環引物輔助的等溫核酸擴增方法

有效

• 申請號: 202110361417.0
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN112980928B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發明（設計）人: 羅光成;易婷婷;郭曉蘭;張國元
• 申請（專利權）人: 川北醫學院附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 南充聚力三新知識產權代理有限責任公司 51207
• 代理人: 劉東

一種莖環引物輔助的等溫核酸擴增技術，其特征在于，按下列步驟進行：a、SPA的引物設計：首先針對模板設計兩條普通引物，即正向引物FP和反向引物BP；b、設計好普通引物后，再在FP和BP的5’端添加莖環序列，形成一對莖環引物，即正向莖環引物SFP和反向莖環引物SBP；c、SPA引物混合液液配制：SPA的擴增引物由普通引物FP、BP和莖環引物SFP、SBP混合而成；d、SPA緩沖液配制2×SPAMix：稱取氯化鉀，硫酸銨，七水硫酸鎂，甜菜堿，Tris?HCl，dNTP，1.0mL100倍稀釋的SYBR?green?Ⅰ，吐溫?20，充分溶解并定容，每管分裝?20°C保存；e、SPA反應液配制：SPA反應為10?50μL體系。本方法具有操作簡單、快速靈敏、經濟實惠等優點，可實現核酸的快速擴增和檢測，特別適用于現場檢測和快速篩查。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，尤其是一種莖環引物輔助的等溫核酸擴增方法。

背景技術

?核酸擴增技術是生命科學研究中應用最為廣泛的檢查技術之一，在基礎研究、臨床疾病診斷、傳染病防控、食品安全和環境監測等領域都起著非常重要的作用。核酸擴增技術主要有兩大類：一類是基于溫度循環的聚合酶鏈式反應（Polymerase?chain?reaction，PCR），另一類是基于恒定反應溫度的等溫擴增技術（Isothermal?amplificationtechnology，IAT）。

?PCR是目前應用最為廣泛的核酸擴增技術，其擴增原理較為簡單，只需要一對引物和一種DNA聚合酶就能實現擴增反應。因此，PCR技術問世后就在基礎研究和臨床實踐中得到了廣泛應用。但隨著醫療環境的發展，醫生和患者對核酸檢測提出了更快、更準、更經濟等要求。PCR的缺點也變得非常突出。因為，PCR技術需要昂貴的溫度循環來實現擴增反應，以及需要專業的技術人員才能實現核酸檢測。這使得PCR難以用于床旁檢測、現場檢測、家庭檢測和經濟落后地區的檢測。由于快速檢測和現場檢測對基本診斷和傳染病防控至關重要，故具有簡單快速、靈敏高效、經濟實惠等特點的等溫擴增技術，近年來受到高度關注。

等溫擴增技術是一種在恒定溫度下擴增和檢測核酸技術，具有簡單、快速、高效的特點。在過去的二十年中，人們已經發明了十余個的等溫擴增技術，包括環介導的等溫擴增（LAMP），重組酶聚合酶擴增（RPA），解旋酶依賴性等溫擴增（HDA），滾環擴增（RCA），基于核酸序列的等溫擴增（NASBA），鏈置換擴增（SDA）等。遺憾的是，這些等溫擴增技術都有一些缺點，因此都沒能在臨床實踐中廣泛使用。

?LAMP是目前使用相對廣泛的等溫擴增技術，其典型缺點就是引物設計復雜、引物數量繁多、擴增特異性較差。高效的LAMP擴增需要針對模板的八個區段設計出6條引物，這不僅使得引物設計難度大，還進一步導致了LAMP技術的背景擴增較強和特異性較差。引物繁多不僅極易導致引物二聚體，還增加了引物與背景核酸的錯配幾率，從而導致非特異性擴增。

?RPA也是近年來應用較為廣泛的等溫擴增技術，但實現RPA擴增至少需要5種蛋白質、兩條引物和一條探針（SauDNA聚合酶，RecA重組酶，單鏈DNA結合蛋白，T4?UvsY蛋白和肌酸激酶，前引物、后引物和標記THF的熒光探針）。因此，RPA試劑成分復雜、價格昂貴。HAD需要修飾dNTP底物，且非特異性擴增明顯。RCA只能擴增環狀模板。由于現有等溫擴增技術均存在一些缺陷。因此，研發更加靈敏特異、簡單可靠、經濟實惠的等溫擴增技術才有望實現廣泛的臨床應用。

與本發明最為接近的現有技術為LAMP技術，其技術原理和實現方案介紹如下：

LAMP的技術原理：