[發明專利]一種莖環引物輔助的等溫核酸擴增方法

有效

• 申請號: 202110361417.0
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN112980928B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發明（設計）人: 羅光成;易婷婷;郭曉蘭;張國元
• 申請（專利權）人: 川北醫學院附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 南充聚力三新知識產權代理有限責任公司 51207
• 代理人: 劉東

1.?一種非診斷與治療目的莖環引物輔助的等溫核酸擴增（Stem-loop-primerassisted?isothermal?amplification，SPA）方法，其特征在于，按下列步驟進行：

a、SPA的引物設計：首先針對模板設計兩條普通引物，即正向引物FP和反向引物BP；

b、設計好普通引物后，再在FP和BP的5’端添加莖環序列，形成一對莖環引物，即正向莖環引物SFP和反向莖環引物SBP；

c、SPA引物混合液液配制：SPA的擴增引物由普通引物FP、BP和莖環引物SFP、SBP混合而成；

d、SPA緩沖液配制2×?SPAMix：稱取氯化鉀，硫酸銨，七水硫酸鎂，甜菜堿，Tris-HCl，dNTP，1.0?mL100倍稀釋的SYBR?green?Ⅰ，吐溫-20，充分溶解并定容，每管分裝-20°C?保存；

e、SPA反應液配制：SPA反應為10-50μL體系；

所述步驟a中，3’端引物二聚體的△G＜2.0?kcal/mol，FP和BP的Tm值在45-55℃之間，FP和BP的擴增產物長度在40-80bp之間；

所述步驟b中，莖環序列的莖長為6-14?bp；

所述步驟c中，莖環引物在引物混合物中的所占比為1-50%，混合引物的濃度為3-6μM；

所述步驟d中，稱取0.149?g氯化鉀，0.264?g硫酸銨，0.395?g七水硫酸鎂，15g甜菜堿，3.0?mL?1.5M?pH=8.5的Tris-HCl，10.0?mL?25?mM的dNTP，1.0?mL100倍稀釋的SYBR?greenⅠ，2.0?mL吐溫-20，充分溶解并定容到100?ml，2.0?mL?每管分裝并-20°C?保存；

所述步驟e中，SPA反應為25?μL體系，包括12.5?μL的2×?SPAMix，0.5-1μL?8U/μL的BstDNA聚合酶，2-5?μL的引物混合物，待測模板，最后補水至25?μL，將反應管置于實時熒光恒溫儀55-65°C溫度下，孵育60-120分鐘。