[發(fā)明專利]一種肽鏈水解試劑及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110360904.5
• 申請(qǐng)日: 2021-04-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113125594B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 倪鋒;高新昌;衣大龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽國(guó)肽生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/30;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/72;G01N30/86
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 程曉明

本發(fā)明公開(kāi)了一種肽鏈水解試劑及其制備方法和應(yīng)用，設(shè)計(jì)了一種肽鏈水解試劑及其制備方法，可以用于標(biāo)記和水解多肽或氨基酸；并公開(kāi)了上述肽鏈水解試劑在氨基酸檢測(cè)方法的應(yīng)用，具體為：利用肽鏈水解試劑水解多肽或蛋白質(zhì)；旋蒸，再用水溶解并將pH調(diào)至中性；加入金屬螯合劑后，離心，取上清液，得到上清液的總離子質(zhì)量色譜圖；提取離子峰得到選擇離子質(zhì)量色譜圖，根據(jù)水解產(chǎn)物的同位素二級(jí)碎片離子不相等的特性建立關(guān)系式，得到比值；分別獲得多肽或蛋白質(zhì)中谷氨酸和天冬氨酸的總含量，根據(jù)比值即可計(jì)算出實(shí)際含量；優(yōu)點(diǎn)在于可以對(duì)多肽或蛋白質(zhì)中的谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸這4種氨基酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量，偏差小于10%。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于氨基酸檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種肽鏈水解試劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)在人體代謝中扮演著重要的角色，蛋白質(zhì)的定量測(cè)定在食品，醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中具有重要的意義。氨基酸是既含氨基(-NH₂)又含羧基(-COOH)的有機(jī)化合物的統(tǒng)稱，是蛋白質(zhì)或多肽水解的產(chǎn)物，蛋白質(zhì)中的氨基酸進(jìn)行定性定量分析也是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)。

目前蛋白質(zhì)中氨基酸分析方法主要有酸水解法，堿水解法和酶法。酸水解法會(huì)造成谷氨酰胺和天冬酰胺的分解，色氨酸也會(huì)被破壞；堿性水解一般采用NaOH、KOH等強(qiáng)堿，但在該水解條件下谷氨酰胺，天冬酰胺，蘇氨酸，絲氨酸，精氨酸和半胱氨酸均遭到破壞(龔天理，劉付芳，王衛(wèi)，等.食品中氨基酸測(cè)試的發(fā)展[J].中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化，2018(S1):156-159.)；酶水解氨基酸水解往往不徹底，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，而且引入干擾。

現(xiàn)行的氨基酸檢測(cè)方法GB5009.124-2016采用酸水解法，規(guī)定了茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀進(jìn)行食品中氨基酸的測(cè)定：將食品中的蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成為游離氨基酸，經(jīng)離子交換柱分離后，與茚三酮溶液產(chǎn)生顏色反應(yīng)，再通過(guò)可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器測(cè)定氨基酸的含量；但是利用酸水解法處理多肽時(shí)，谷氨酰胺和天冬酰胺，這兩種具有重要營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生理功能的氨基酸，會(huì)分別水解成谷氨酸(如附圖1(a)所示)和天冬氨酸(如附圖1(b)所示)，造成所測(cè)得的天冬氨酸和谷氨酸的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一部分是來(lái)源于天冬酰胺和谷氨酰胺，因此無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)到樣品中原有的谷胺酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸這四種氨基酸的真實(shí)含量，同時(shí)色氨酸在酸性條件下會(huì)被破壞，因此現(xiàn)行的國(guó)標(biāo)法只能測(cè)定包括丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、甘氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸等15種氨基酸，不能同時(shí)對(duì)含有谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸的多肽或蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，因此不適用于含有谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸的多肽或蛋白質(zhì)的樣品的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種肽鏈水解試劑、制備方法及將該肽鏈水解試劑用于氨基酸檢測(cè)方法的應(yīng)用，通過(guò)制備一種新型的肽鏈水解試劑，將肽鏈水解的同時(shí)對(duì)水解產(chǎn)物氨基酸進(jìn)行O¹⁸同位素標(biāo)記，再利用液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用下水解產(chǎn)物的同位素二級(jí)碎片離子不相等的特性，可以對(duì)多肽或蛋白質(zhì)樣品中的谷胺酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種氨基酸的同時(shí)測(cè)定和準(zhǔn)確定量。

為解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種肽鏈水解試劑，由以下物質(zhì)組成：鹽酸二氧六環(huán)溶液、重氧水和二價(jià)金屬氯化物溶液；其中，所述鹽酸二氧六環(huán)溶液、所述重氧水和所述二價(jià)金屬氯化物溶液的摩爾比為(2～4):(35～40):(0.005～0.012)，所述的肽鏈水解試劑中的肽鏈含有谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸4種氨基酸中的一種或多種。

所述鹽酸二氧六環(huán)溶液中的鹽酸的濃度為1.7～2.2mol/L。