[發(fā)明專利]一種新型冠狀病毒COVID-19-S1蛋白的表達(dá)和純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110359951.8
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN112812156B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊萍萍
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門寶太生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K14/165
• 分類號: C07K14/165;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C12N15/50;C12N15/85;C12N15/67
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 徐翔

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型冠狀病毒COVID?19?S1蛋白的表達(dá)和純化方法。本發(fā)明提供的方法，主要包括構(gòu)建COVID?19?S1蛋白表達(dá)質(zhì)粒、將COVID?19?S1蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)表達(dá)COVID?19?S1蛋白、純化COVID?19?S1蛋白等過程。本發(fā)明將能在293F細(xì)胞中高分泌表達(dá)蛋白的信號肽與Kozak區(qū)和編碼人COVID?19?S1蛋白的基因進(jìn)行重組，來提高目的蛋白的表達(dá)量和分泌量。采用本發(fā)明提供的方法，可以解決新型冠狀病毒COVID?19?S1蛋白分泌量低、純度低的問題，為免疫學(xué)快速診斷、制備單抗、開展解析蛋白結(jié)構(gòu)研究等提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及涉及一種新型冠狀病毒COVID-19-S1蛋白制備技術(shù)。

背景技術(shù)

冠狀病毒肺炎是2019年新興的一種傳染病，目前正在全球范圍內(nèi)傳播。它是由新型冠狀病毒中引起嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥的冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起的。SARS-CoV-2的刺突蛋白(S)在受體識別和細(xì)胞膜融合過程中起關(guān)鍵作用，由兩個亞基S1和S2組成。S1亞基中包含一個受體結(jié)合域，該域能識別并結(jié)合宿主受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2，而S2亞基能通過兩七重復(fù)域形成六螺旋束，從而介導(dǎo)病毒細(xì)胞膜融合。大量糖基化的S蛋白覆蓋SARS-CoV-2的表面并與宿主細(xì)胞受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)結(jié)合，介導(dǎo)病毒細(xì)胞進(jìn)入。

對于冠狀病毒來說，S蛋白在很大程度上決定了其種屬特異性，因此也是冠狀病毒表面最為重要的抗原決定簇。另外，由于S蛋白作為抗原能夠誘導(dǎo)宿主體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗體，這些特異性的抗體也可作為診斷冠狀病毒感染的靶分子，直接從血清樣品中進(jìn)行檢測。然而，哺乳動物細(xì)胞蛋白表達(dá)的S1蛋白的表達(dá)是相對較低的，通過增加細(xì)胞分泌表達(dá)的能力能夠顯著提高S1蛋白的產(chǎn)量，同時也更加便于蛋白的純化。

在293F細(xì)胞表達(dá)分泌性蛋白質(zhì)過程中，起初會合成由15-30個疏水性氨基酸組成的信號肽，信號肽隨后被細(xì)胞質(zhì)中的信號識別顆粒(Signal-Recognition Particle,SRP)所識別，識別后導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成暫停，隨后核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合，信號肽依靠其疏水性插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔內(nèi)，在核糖體結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜后，SRP將會離開，處于暫停狀態(tài)的蛋白質(zhì)合成重新開始，而后信號肽酶對信號肽進(jìn)行切割。所以，一個合適的信號肽也有助于提高重組蛋白的表達(dá)水平。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種用人胚腎細(xì)胞表達(dá)外源蛋白時信號肽的選擇方法，通過該方法可以選擇適合重組新冠病毒刺突蛋白外分泌表達(dá)的信號肽；本發(fā)明的目的之二在于插入Kozak區(qū)，提高重組COVID-19-S1蛋白的表達(dá)量。本發(fā)明通過將能在293F細(xì)胞中高分泌表達(dá)蛋白的信號肽與Kozak區(qū)和外源目的蛋白基因進(jìn)行重組，提高了目的蛋白的表達(dá)量和分泌量。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種新型冠狀病毒COVID-19-S1蛋白表達(dá)和純化的方法，包括如下步驟：

S1、構(gòu)建COVID-19-S1蛋白表達(dá)質(zhì)粒：選擇編碼COVID-19-S1蛋白的基因，根據(jù)293F細(xì)胞偏好進(jìn)行密碼子優(yōu)化，選擇信號肽，將目的基因與選擇出的信號肽連接，在信號肽前端引入Kozak區(qū)，將優(yōu)化后的基因序列克隆到pcDNA3.1-myc-HisA載體中，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，再用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，用無菌水洗脫，用分光光度計測得質(zhì)粒濃度為1mg/mL，獲得pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1質(zhì)粒的目的DNA；