[發(fā)明專利]一種新型冠狀病毒COVID-19-S1蛋白的表達(dá)和純化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110359951.8
• 申請(qǐng)日: 2021-04-02
• 公開（公告）號(hào): CN112812156B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊萍萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廈門寶太生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/165
• 分類號(hào): C07K14/165;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C12N15/50;C12N15/85;C12N15/67
• 代理公司: 廣州科沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 徐翔

1.一種新型冠狀病毒COVID-19-S1蛋白表達(dá)和純化的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、構(gòu)建COVID-19-S1蛋白表達(dá)質(zhì)粒：選擇編碼COVID-19-S1蛋白的基因，根據(jù)293F細(xì)胞偏好進(jìn)行密碼子優(yōu)化，選擇信號(hào)肽，將目的基因與選擇出的信號(hào)肽連接，在信號(hào)肽前端引入Kozak區(qū)，將優(yōu)化后的基因序列克隆到pcDNA3.1-myc-HisA載體中，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，再用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，用無菌水洗脫，用分光光度計(jì)測得質(zhì)粒濃度為1mg/mL，獲得pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1質(zhì)粒的目的DNA；

S2、將COVID-19-S1蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：取1μL步驟S1獲得的pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1質(zhì)粒的目的DNA轉(zhuǎn)化到Escherichia coli DH5α感受態(tài)菌株中，冰浴30min，42℃熱激90s，再冰浴5min后，加入500μL的LB液體培養(yǎng)基，放在溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為150rpm的搖床培養(yǎng)1h；然后取30μL培養(yǎng)液涂布到含有氨芐抗生素LB固體培養(yǎng)板上，在溫度為37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時(shí)后，從中挑選出單一菌落加入到含有氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，置于溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為220rpm的搖床上培養(yǎng)16小時(shí)后，取狀態(tài)良好的293F細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，用天根高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒提取，獲得pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1質(zhì)粒的目的DNA；

S3、培養(yǎng)表達(dá)COVID-19-S1蛋白：通過PEI轉(zhuǎn)染法將步驟S2所得pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19-S1質(zhì)粒的目的DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)293F細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后，置于37℃、8％CO₂、120rpm培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，補(bǔ)加與培養(yǎng)液等體積的OPM-293CD05新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至4×10⁶個(gè)/mL密度時(shí)，每天添加1％體積比的OPM-293ProFeed補(bǔ)料培養(yǎng)基，放回37℃、8％CO₂、120rpm培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)96h，獲得表達(dá)COVID-19-S1蛋白的293F細(xì)胞培養(yǎng)液；

S4、純化COVID-19-S1蛋白：將步驟S3所得表達(dá)COVID-19-S1蛋白的293F細(xì)胞培養(yǎng)液在轉(zhuǎn)速為1500rpm的條件下離心15min，收集上清，用0.45μm的濾膜過濾，選用鎳柱進(jìn)行蛋白純化；鎳柱使用前用50倍柱體積含有100mM Tris pH為7.5的HCl、300mM NaCl、10mMimidazole的平衡緩沖液對(duì)柱子進(jìn)行平衡，再將離心取得的上清液流過柱子，再依次用20倍柱體積含0mM、50mM、150mM、300mM的咪唑濃度的洗脫液進(jìn)行洗脫，收集不同咪唑濃度的洗脫液，其中150mM咪唑的洗脫液中含有目的蛋白COVID-19-S1蛋白，將純化的COVID-19-S1蛋白進(jìn)行透析，即得；

所述步驟S1所述編碼COVID-19-S1蛋白為新冠病毒刺突蛋白S1，大小為120kDa，編碼所述新冠病毒刺突蛋白S1的基因序列信息如SEQ ID NO.3所示；

所述步驟S1所述選擇信號(hào)肽的過程為：

1)選擇新冠病毒刺突蛋白S1作為蛋白序列，將編碼蛋白的基因序列針對(duì)293F細(xì)胞宿主進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的基因序列如SEQ ID NO.4所述，然后將所述基因序列構(gòu)建進(jìn)pcDNA3.1-myc-HisA載體，獲得目的基因載體；

2)從已報(bào)道的文獻(xiàn)中選取能有效分泌表達(dá)外源目的基因的信號(hào)肽作為待選擇信號(hào)肽，將待選擇信號(hào)肽分別與步驟1)所得目的基因載體連接，連接時(shí)在待選擇信號(hào)肽前分別選用引入Kozak區(qū)和不引入Kozak區(qū)兩種連接方式，獲得重組蛋白；

3)使用信號(hào)肽分析工具分析步驟2)所得重組蛋白的氨基酸序列，選擇切割位點(diǎn)分析準(zhǔn)確且落在所述蛋白序列前的信號(hào)肽，即為適合新冠病毒刺突蛋白表達(dá)的信號(hào)肽；

所述步驟1)所述的蛋白序列為新冠病毒刺突蛋白S1的16-685位氨基酸序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型冠狀病毒COVID-19-S1蛋白表達(dá)和純化的方法，其特征在于，所述步驟S1中的信號(hào)肽為TPA信號(hào)肽，編碼TPA信號(hào)肽序列的核苷酸信息如SEQ ID NO.1所示。