[發(fā)明專利]重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建透明質(zhì)酸工程菌株的方法及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110359257.6
• 申請(qǐng)日: 2021-04-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113151336B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊艮;江曉路;張京良
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東銀河生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/74
• 分類號(hào): C12N15/74;C12N1/21;C12N15/57;C12P19/26;C12N1/06;C12R1/46
• 代理公司: 濟(jì)寧匯景知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37254
• 代理人: 朱培

本發(fā)明公開(kāi)了一種重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建透明質(zhì)酸工程菌株及使用方法，屬于生物活性物質(zhì)提取技術(shù)領(lǐng)域，其特征在于重組表達(dá)質(zhì)粒包含一段編碼重組型蛋白表達(dá)產(chǎn)物基因的聚核苷酸；編碼重組型蛋白表達(dá)產(chǎn)物基因的聚核苷酸包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白酶基因的聚核苷酸；通過(guò)發(fā)酵制備高分子透明質(zhì)酸發(fā)酵液，包括破壁工序、分離工序、提取工序和水解工序，本發(fā)明的有益效果是：幾丁質(zhì)酶進(jìn)行破壁處理，利用產(chǎn)蛋白酶將糖蛋白變性水解后與透明質(zhì)酸脫離；而分離后的透明質(zhì)酸能夠順利通過(guò)細(xì)胞膜到細(xì)胞膜外，達(dá)到了將糖蛋白變性后與透明質(zhì)酸分離的目的，規(guī)避了因內(nèi)容物釋放導(dǎo)致透明質(zhì)酸酶水解效率差和雜質(zhì)難以處理的問(wèn)題，保證了低分子透明質(zhì)酸高收率和低蛋白雜質(zhì)。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物活性物質(zhì)提取技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建透明質(zhì)酸工程菌株及使用方法。

背景技術(shù)：

透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)，又稱為玻尿酸，是一種以D-葡萄糖醛酸(Glca)和N-乙酰-葡萄糖胺(GlcNAC)為雙糖單位聚合而成的酸性粘多糖。廣泛存在于動(dòng)物和人體的組織細(xì)胞間質(zhì)和某些細(xì)菌的莢膜中。透明質(zhì)酸廣泛用于醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域，分子量一般為10 ⁵-10 ⁷Da。寡聚透明質(zhì)酸是指分子量小于 10kDa的透明質(zhì)酸。研究表明，分子量對(duì)透明質(zhì)酸的活性有很大影響，但是對(duì)分子的滲透性影響很大，因此小分子透明質(zhì)酸在生物滲透，生物降解方面具有獨(dú)特的特性，極具應(yīng)用價(jià)值。

透明質(zhì)酸的制備方法主要有動(dòng)物組織提取法和微生物發(fā)酵法，但得到透明質(zhì)酸分子量一般在0.8-1.5×10⁶Da，要得到更小分子量的透明質(zhì)酸必須經(jīng)過(guò)水解，一般水解方法有三種：物理法、化學(xué)法和酶法，但這些方法水解過(guò)程都是隨機(jī)性的，水解產(chǎn)物的分子量分布較廣，直接使用就會(huì)影響產(chǎn)品功效，要得到分子量分布窄的低分子量透明質(zhì)酸就必須再次經(jīng)過(guò)分步提純法才能獲得，但這就增加了生產(chǎn)成本，也影響產(chǎn)品收率。

現(xiàn)在有較多的專利和文獻(xiàn)報(bào)道透明質(zhì)酸的制備方法，在制備小分子或寡聚透明質(zhì)酸方面都是采用水解工序與提取工序獨(dú)立分批的傳統(tǒng)方式，難于同時(shí)兼顧到提高產(chǎn)量質(zhì)量和降低成本，給產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來(lái)了難點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容：

為解決上述問(wèn)題，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種低分子量透明質(zhì)酸的提取及制備方法，能夠有效的解決酸堿提取時(shí)，透明質(zhì)酸容易發(fā)生分解和結(jié)構(gòu)破壞的問(wèn)題；

解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是：在提取過(guò)程中一些非糖物質(zhì)被提出，如透明質(zhì)酸外具有糖蛋白，糖蛋白在后續(xù)粗多糖的分離純化會(huì)比較困難。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的具體技術(shù)方案為：

獸疫鏈球菌，該菌株于2020年11月23日保藏于《中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心》，保藏號(hào)為：CGMCC NO.17774，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，該菌株命名為ps01，獸疫鏈球菌S.zooepidemicus；

一種重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于所述質(zhì)粒的載體基于pCOLADuet-1，所述重組表達(dá)質(zhì)粒包含：一段編碼重組型蛋白表達(dá)產(chǎn)物基因的聚核苷酸；

所述編碼重組型蛋白表達(dá)產(chǎn)物基因的聚核苷酸包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白酶基因的聚核苷酸；所述宿主細(xì)胞為產(chǎn)透明質(zhì)酸的獸疫鏈球菌；

所述表達(dá)蛋白酶基因的聚核苷酸如SEQ NO：1所示的核苷酸序列。

所述的蛋白酶基因的聚核苷酸編碼蛋白的氨基酸序列如SEQNO.2所示。

一種根據(jù)所述的重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建透明質(zhì)酸工程菌株的方法：其特征在于包括如下步驟：

第1步：利用引物1和引物2得到蛋白酶基因，連接到所述載體pCOLADuet-1 上，構(gòu)建表達(dá)載體pCOLADuet-1-S1；

引物1:5′-ATGAAGCAGCAATGGTTGTCGGC-3′；