[發明專利]重組表達質粒構建透明質酸工程菌株的方法及應用

有效

• 申請號: 202110359257.6
• 申請日: 2021-04-02
• 公開（公告）號: CN113151336B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 楊艮;江曉路;張京良
• 申請（專利權）人: 山東銀河生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12N15/57;C12P19/26;C12N1/06;C12R1/46
• 代理公司: 濟寧匯景知識產權代理事務所(普通合伙) 37254
• 代理人: 朱培

1.一種重組表達質粒構建透明質酸工程菌株的方法，其特征在于：重組表達質粒的載體為pCOLADuet-1，所述重組表達質粒包含：一段編碼重組型蛋白表達產物基因的聚核苷酸；所述編碼重組型蛋白表達產物基因的聚核苷酸包括在宿主細胞中表達蛋白酶基因的聚核苷酸；所述宿主細胞為產透明質酸的獸疫鏈球菌；包括如下步驟：

第1步：利用引物1和引物2得到蛋白酶基因，連接到所述載體pCOLADuet-1上，構建表達載體pCOLADuet-1- S1；

引物1:5′-ATGAAGCAGCAATGGTTGTCGGC-3′；

引物2：5′-TCAGTAGCGCAACGTCTCTACCG-3′；

第2步：將步驟1中構建的表達載體pCOLADuet-1-S1導入宿主產透明質酸的獸疫鏈球菌得到重組獸疫鏈球菌工程菌株，并利用培養基進行菌種發酵培養；

第3步：發酵培養基為：葡萄糖40g/L、(NH₄)₂SO₄ 30g/L、玉米漿20g/L、KH₂PO₄ 1g/L、K₂HPO₄ 0.5g/L、MgSO₄ 5g/L、FeSO₄·7H₂O 0 .01g/L、MnSO₄·H₂O 0 .01g/L、谷氨酰胺1 .5g/L、精氨酸0 .5g/L；

發酵過程溫度控制在32℃，轉速為200轉/分鐘，在發酵3h時，加入10 .0M乳糖誘導蛋白酶的表達和透明質酸的產生，發酵72h后檢測發酵液中透明質酸的含量；

所述表達蛋白酶基因的聚核苷酸如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，

所述的蛋白酶基因的聚核苷酸編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根據權利要求1所述的重組表達質粒構建透明質酸工程菌株的方法，其特征在于所述的蛋白酶基因通過PCR擴增獲得。

3.一種透明質酸的制備方法，其特征在于采用權利要求1或2中透明質酸的發酵液，包括破壁工序、分離工序、提取工序和水解工序；

所述破壁工序指在具有透明質酸的發酵液中加入幾丁質酶進行破壁處理，獲得具有透明質酸的獸疫鏈球菌原生質體的處理液；

所述分離工序將含有透明質酸的懸濁混合液溫度提升到55-60℃，將透明質酸從破壁處理的細胞中分離出來；

所述提取工序指將混合液用0.22μm的過濾紙板過濾，去除含有透明質酸的原生質體，提取獲得透明質酸；

所述水解工序是指將獲得的透明質酸溶液加入透明質酸酶，酶解4h后，得到水解液，并通過超濾膜進行過濾截留，得到低分子量透明質酸濾液。

4.根據權利要求3所述的透明質酸的制備方法，其特征在于所述破壁工序反應溫度為35-45℃，所述幾丁質酶的添加量為處理液質量的0.2-1.2‰。

5.根據權利要求4所述的透明質酸的制備方法，其特征在于所述水解工序中：透明質酸酶的添加量為高分子量透明質酸溶液體積的0 .5％-10％；酶解的溫度為30-50℃；酶解的pH值為4 .5-7 .0。

6.根據權利要求5所述的透明質酸的制備方法，其特征在于含有所述透明質酸的懸濁混合液為透明質酸和內容物中含有蛋白的透明質酸菌體原生質體的混合物。