[發明專利]一種人腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白、多克隆抗體及其應用

在審

• 申請號: 202110357650.1
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113121657A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 陶玲;易亮;晉樂飛;趙茜;段廣才;王寅彪;徐鵬衛;吳衛東
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院
• 主分類號: C07K14/085
• 分類號: C07K14/085;C12N15/70;C07K16/10;C07K16/06;G01N33/569
• 代理公司: 新鄉市平原智匯知識產權代理事務所(普通合伙) 41139
• 代理人: 路寬

本發明公開了一種人腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白、多克隆抗體及其應用。本發明的技術方案要點為：提供了一種EV?A71和CV?A2VP1重組蛋白純化、多克隆抗體制備的方法，并應用制備的小鼠多克隆抗體建立了蛋白質免疫印跡和免疫過氧化物酶單層細胞試驗檢測EV?A71和CV?A2的方法。本發明所述的這種EV?A71和CV?A2VP1蛋白純化方法簡便快捷、操作性強、回收率高，多克隆抗體制備方法無需免疫佐劑，節約了成本，制備的小鼠多克隆抗體能檢測細胞樣品中的EV?A71和CV?A2，特異性和重復性好。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種人腸道病毒71型(humanenterovirus A71,EV-A71)和柯薩奇病毒A組2型(coxsackievirus A2,CV-A2)VP1重組蛋白、多克隆抗體及其應用。

背景技術

人腸道病毒71型(human enterovirus A71,EV-A71)和柯薩奇病毒A組2型(coxsackievirus A2,CV-A2)都屬于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬(Enterovirus)A組腸道病毒(Enterovirus A)。EV-A71和CV-A2感染都能引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)。EV-A71感染引起的HFMD大多是自限性的，但有一些感染可以引起嚴重的神經系統疾病，如無菌性腦膜炎、腦干腦炎，甚至死亡。CV-A2感染主要引起皰疹性咽峽炎，較少引起神經系統疾病，但有報道CV-A2感染會引起小兒麻痹癥樣麻痹、合并神經表現、心肌炎、嚴重腦炎甚至死亡。

EV-A71和CV-A2都是單股正鏈RNA病毒。EV-A71基因組長約7.5kb，只有一個編碼了2193個氨基酸的開放閱讀框(open reading frame,ORF)，兩端分別為5′和3′非翻譯區(untranslated regions,UTRs)。在EV71復制過程中，其編碼的多聚蛋白被細分為P1、P2和P3區域：P1編碼四種結構蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)，而P2和P3編碼七種非結構蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。CV-A2基因組長約7.4kb，編碼約2190個氨基酸的多聚蛋白，結構與EV-A71類似。

腸道病毒的VP1蛋白是主要的病毒中和決定因素。VP1的核苷酸序列分析可以替代中和試驗分型方法，用來區分腸道病毒的血清型。EV-A71的VP1蛋白含有297個氨基酸，顯示出與病毒血清型相應的完整的遺傳多樣性，可作為EV-A71血清型分類的依據。EV-A71的VP1蛋白可誘導對EV71的有效免疫保護，是抗EV71感染的理想候選蛋白，其N末端可能具有重要的中和抗體決定簇，可能作為急性感染診斷和治療抗體的的靶點。CV-A2全長VP1核苷酸序列有885bp，編碼295個氨基酸。目前關于CV-A2 VP1蛋白的研究報道較少。

發明內容

本發明解決的技術問題是提供了一種人腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白、多克隆抗體及其應用，本發明分別擴增了EV-A71和CV-A2的全長VP1基因并進行了原核表達，采用超聲破碎、差速離心、氯化鉀染色切膠回收、液氮研磨等簡便易行的方法分別對EV-A71 VP1重組蛋白和CV-A2 VP1重組蛋白進行了純化，通過腹腔注射免疫小鼠成功地制備了小鼠抗EV-A71 VP1多克隆抗體和CV-A2 VP1多克隆抗體，并應用多克隆抗體通過蛋白質免疫印跡(Western blot)和免疫過氧化物酶單層細胞試驗(immunoperoxidasemonolayer assay,IPMA)檢測EV-A71 VP1和CV-A2 VP1在病毒感染人橫紋肌肉瘤細胞RD中的表達。

本發明為解決上述技術問題采用如下技術方案：

一種人腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白，其特征在于：該人腸道病毒71型VP1重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。