[發(fā)明專利]一種人腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白、多克隆抗體及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110357650.1
• 申請(qǐng)日: 2021-04-01
• 公開（公告）號(hào): CN113121657A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陶玲;易亮;晉樂(lè)飛;趙茜;段廣才;王寅彪;徐鵬衛(wèi);吳衛(wèi)東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C07K14/085
• 分類號(hào): C07K14/085;C12N15/70;C07K16/10;C07K16/06;G01N33/569
• 代理公司: 新鄉(xiāng)市平原智匯知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 41139
• 代理人: 路寬

1.一種人腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白，其特征在于：該人腸道病毒71型VP1重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

2.一種權(quán)利要求1所述的人腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白的制備方法，其特征在于具體步驟為：

步驟S1：構(gòu)建攜帶EV-A71 VP1基因的重組質(zhì)粒pET-28a(+)EV-A71 VP1和攜帶有CV-A2VP1基因的重組質(zhì)粒pET-28a(+)CV-A2 VP1；

步驟S2：將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)EV-A71 VP1重組蛋白和CV-A2 VP1重組蛋白，對(duì)EV-A71 VP1重組蛋白和CV-A2 VP1重組蛋白分別進(jìn)行純化即得人腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白的制備方法，其特征在于步驟S2的具體過(guò)程為：將含有EV-A71 VP1重組蛋白和CV-A2 VP1重組蛋白的細(xì)菌裂解液，分別用超聲波破碎后進(jìn)行差速離心，重復(fù)四次，最后3000×g離心沉淀包涵體，用3/80初始菌液體積重懸；用12％(m/V)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離上述重懸液中的EV-A71 VP1重組蛋白和CV-A2 VP1重組蛋白，用冰冷的5％(m/V)氯化鉀水溶液對(duì)分離膠進(jìn)行漂染，切膠回收乳白色蛋白條帶；在回收膠中加入適量磷酸鹽緩沖液后用液氮研磨三次，最終獲得純化的EV-A71 VP1重組蛋白和CV-A2 VP1重組蛋白。

4.一種基于人腸道病毒71型VP1重組蛋白的多克隆抗體及基于柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白的多克隆抗體。

5.一種權(quán)利要求4所述的基于人腸道病毒71型VP1重組蛋白的多克隆抗體及基于柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征在于：將純化后的EV-A71 VP1重組蛋白和CV-A2 VP1重組蛋白分別作為抗原通過(guò)腹腔注射免疫Balb/c小鼠，制備小鼠多克隆抗體anti-EV-A71 VP1和anti-CV-A2 VP1。

6.一種權(quán)利要求4所述的基于人腸道病毒71型VP1重組蛋白的多克隆抗體及基于柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征在于具體過(guò)程為：將純化的EV-A71 VP1重組蛋白和CV-A2 VP1重組蛋白分別免疫12周齡Balb/c小鼠，首次免疫用200μL劑量，以后每隔三到四周加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫用100～150μL劑量，免疫均采用腹腔注射方法；第四次免疫后三周和第五次免疫后第3-4天分別取少量血清，用蛋白質(zhì)免疫印跡測(cè)定抗體效價(jià)，抗體效價(jià)在1:5000及以上的小鼠，在第五次免疫后9-10天取血并分離血清，獲得小鼠多克隆抗體anti-EV-A71 VP1和anti-CV-A2 VP1。

7.權(quán)利要求4所述的基于人腸道病毒71型VP1重組蛋白的多克隆抗體及基于柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白的多克隆抗體在制備人腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組2型特異性檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的基于人腸道病毒71型VP1重組蛋白的多克隆抗體在制備人腸道病毒71型免疫印跡或免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)試劑中的應(yīng)用以及基于柯薩奇病毒A組2型VP1重組蛋白的多克隆抗體在制備柯薩奇病毒A組2型免疫印跡或免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。