[發明專利]一種釀酒酵母表達長效重組人絲聚蛋白及其應用

有效

• 申請號: 202110357115.6
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113045638B
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 趙俊;劉潔;劉家爐;凡玉芳;孔國慶;周煒;何志遠
• 申請（專利權）人: 蕪湖英特菲爾生物制品產業研究院有限公司;安徽普若汀生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/81;C12N1/19;A61K8/64;A61Q19/00;C12R1/865
• 代理公司: 合肥市澤信專利代理事務所(普通合伙) 34144
• 代理人: 方榮肖

本發明公開了一種釀酒酵母表達長效重組人絲聚蛋白及其應用，該長效重組人絲聚蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，該長效重組人絲聚蛋白的核苷酸序列所對應的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。長效重組人絲聚蛋白的氨基酸序列包括絲聚蛋白的氨基酸序列及人血清白蛋白的氨基酸序列，絲聚蛋白的氨基酸序列包括絲聚蛋白核苷酸序列重復單元C端的一個單體結構所對應的氨基酸序列。本發明提供的長效重組人絲聚蛋白能夠促進角蛋白中間絲聚集并促進中間絲之間的二硫鍵形成、防止表皮水分的丟失和外界過敏物質的入侵以及降低紫外線誘導的表皮細胞凋亡的敏感性。融合HAS有效的提高了重組蛋白的穩定性。

技術領域

本發明涉及新興生物醫學領域，尤其涉及一種釀酒酵母表達長效重組人絲聚蛋白，一種釀酒酵母信號肽重組質粒，一種釀酒酵母分泌表達載體，一種釀酒酵母營養缺陷型菌株，以及一種釀酒酵母表達長效重組人絲聚蛋白在保濕化妝品中的應用。

背景技術

絲聚蛋白(filaggrin，FLG)又稱中間絲聚合蛋白，相對分子質量約35000，主要存在于表皮顆粒層和透明層。它的前體絲聚蛋白原是一個高度磷酸化、富含組氨酸、不溶于水且無活性的多肽，相對分子質量約435000。絲聚蛋白原的編碼基因FLG位于表皮分化復合體內，分子起始端是一個N端區域，該區域有一個鈣結合結構和核定位元件，N端區域之后是10～12個幾乎相同的FLG單體結構，此重復結構具有角蛋白綁定屬性，其末端是C端(結合圖2所示)。絲聚蛋白及其降解產物和衍生物是皮膚的天然保濕因子，對維持皮膚正常pH值、調節蛋白酶活性、表皮屏障的通透性及皮膚對微生物的防御功能起關鍵作用，對維持角質層水合作用非常重要。

人血清白蛋白(Human serum albumin，HAS)是人體血液中的主要蛋白，由585個氨基酸構成，是人體循環系統內的含量最多的可溶性蛋白，在血液中的濃度為34～54g/L。HSA由肝臟合成，血清半衰期長，可達19天。HSA在調節血液滲透壓、營養和促進傷口愈合等方面發揮重要作用，廣泛用于肝硬化腹水、燒傷、休克等臨床治療。此外，HSA具有無免疫原性、人體相容性好、組織分布廣和無酶活等特性，使其成為非常理想的重組蛋白融合載體。通過構建融合蛋白技術能夠增加重組蛋白的分子量從而延長半衰期，有效的提高重組蛋白的穩定性。

目前FLG的基因工程的表達主要是選取FLG單體結構域進行表達或組合表達，以獲得具有不同功能的重組FLG。根據表達載體和宿主菌的不同，主要分為原核表達和真核表達。原核表達系統雖成本低廉，但該系統存在容易形成包涵體、獲得的蛋白生物學活性較低等缺陷，而利用真核表達系統進行外源表達能夠獲得較高活性的目的蛋白。

而現有技術中經大腸桿菌表達的人絲聚蛋白，表達產物需要經純化才能利用，生產成本較高，且原核表達系統存在容易形成包涵體、獲得的重組人絲聚蛋白生物學活性較低等缺陷。經畢赤酵母表達的人絲聚蛋白，因表達的上清液中含有有害甲醇成分，并且去除甲醇成本較高，推廣使用較難。

發明內容

為了克服天然提純人絲聚蛋白工藝復雜、成本高、推廣應用受到限制的缺點；現有技術中現有原核表達系統存在容易形成包涵體、獲得的人絲聚蛋白生物學活性較低等缺陷的技術問題，本發明提供了一種釀酒酵母表達長效重組人絲聚蛋白，一種釀酒酵母信號肽重組質粒，一種釀酒酵母分泌表達載體，一種釀酒酵母營養缺陷型菌株，以及一種釀酒酵母表達長效重組人絲聚蛋白在保濕化妝品中的應用。

本發明采用以下技術方案實現：一種釀酒酵母表達長效重組人絲聚蛋白，該長效重組人絲聚蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。

作為上一步技術方案的改進，長效重組人絲聚蛋白的核苷酸序列所對應的氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。

進一步地，長效重組人絲聚蛋白的氨基酸序列包括絲聚蛋白的氨基酸序列及人血清白蛋白的氨基酸序列；絲聚蛋白的氨基酸序列包括絲聚蛋白核苷酸序列重復單元C端的一個單體結構所對應的氨基酸序列。