[發明專利]一種快速區分稻瘟病菌交配型的PCR-HRM檢測方法

在審

• 申請號: 202110356410.X
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113136447A
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發明（設計）人: 房文文;王海風;郭濤;姜艷芳;張士永
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 張夢澤

1.一種快速區分稻瘟病菌交配型的熒光PCR-HRM檢測引物組，包括MAT1-1擴增引物組和MAT1-2擴增引物組；

所述MAT1-1擴增引物組包括MAT1-1-F和MAT1-1-R；

所述MAT1-1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述MAT1-1-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述MAT1-2擴增引物組包括MAT1-2-F和MAT1-2-R；

所述MAT1-2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述MAT1-2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一種包括權利要求1所述引物組的熒光PCR-HRM檢測試劑盒，所述試劑盒還包括用于熒光PCR擴增的試劑。

3.一種基于權利要求1所述引物組或者權利要求2所述試劑盒的熒光PCR-HRM檢測區分稻瘟病菌交配型的方法，包括以下步驟：

1)提取待區分稻瘟病菌的基因組DNA；

2)以所述待區分稻瘟病菌的基因組DNA為模板，采用所述引物組進行熒光PCR擴增反應，得到待區分稻瘟病菌熒光PCR擴增產物；

3)對所述待區分稻瘟病菌熒光PCR擴增產物進行熔解曲線分析，得到待區分稻瘟病菌熔解溫度；

當所述待區分稻瘟病菌熔解溫度為78～80℃時，則所述待區分稻瘟病菌為MAT1-1交配型；當所述待區分稻瘟病菌熔解溫度為82～84℃時，則所述待區分稻瘟病菌為MAT1-2交配型。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述熒光PCR擴增反應的反應體系以10μL計，包括以下組分：待區分稻瘟病菌的基因組DNA 3μL、10×buffer 1μL、dNTP 0.2μL、20×Evagreen 0.125μL、0.5U Taq DNA Polymerase 0.1μL、所述引物組中的MAT1-1-F、MAT1-1-R、MAT1-2-F和MAT1-2-R各0.2μL以及余量的ddH₂O。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述待區分稻瘟病菌的基因組DNA的濃度為10～50ng/μL；所述10×buffer含有Mg²⁺，所述Mg²⁺的濃度為20mM；所述dNTP的濃度為2.5mM；所述引物組中的MAT1-1-F、MAT1-1-R、MAT1-2-F和MAT1-2-R的濃度分別為0.1mM。

6.根據權利要求3或5所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述熒光PCR擴增反應的反應程序為：94℃預變性2min；94℃變性10s，60℃退火30s，40個循環。

7.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述熔解曲線分析的程序為：95℃，變性15s；60℃退火15s；以0.07℃/s的速率升溫，10次/℃采集熒光信號，至90℃保持1s，進行熔解曲線分析。

8.根據權利要求3或7所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述熔解曲線分析采用的軟件包括LightCycler96。