[發明專利]鑒別呼倫貝爾短尾羊純合雜合子的PCR-RFLP方法及引物

在審

• 申請號: 202110356310.7
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN112899375A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 曹貴方;楊光;宋永利;竇傲蕾;馬騰;智達夫;蘇紅;劉默凝;楊宏新;霍雨佳;李喜和;何亭漪;楊燕燕;達來;李秀男
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/683;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 趙敬

本發明提供了一種鑒別呼倫貝爾短尾羊純雜合個體的PCR?RFLP方法及引物，利用Bci T130I限制性內切酶的特異性識別位點進行基因分型，以樣本基因組DNA為模板，擴增呼倫貝爾短尾羊Brachyury/T基因，所擴增基因長度為203bp。上游引物所在Brachyury/T基因的95879504位點至95879486位點，下游引物位置為95879302位點至95879323位點；將PCR產物進行純化后使用Bci T130I進行酶切；對酶切產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，有著明顯兩條條帶為純合呼倫貝爾短尾羊，明顯三條條帶的為雜合呼倫貝爾短尾羊。本發明操作簡便、反應不需要額外的分析步驟，并通過條帶數量準確分型出純、雜合基因型，酶切體系和時間不會引起Bci T130I酶的星活性。

技術領域

本發明屬于綿羊分子育種鑒定領域，具體涉及一種鑒別呼倫貝爾短尾羊純合雜合子的PCR-RFLP鑒別方法及引物。

背景技術

我們利用基因組重測序技術篩選到與脊椎發育相關的T/Brachyury基因作為候選基因，并確定在呼倫貝爾短尾羊群體中存在穩定T/Brachyury基因c.G334T突變，并證明與“短尾”這一具有經濟價值的性狀相關。綿羊分子育種中：純合子個體相對于雜合子后代性狀表現穩定，通過將種群中純合個體篩選并作為主要繁育對象。而傳統方法主要采用sanger測序法、Taqman探針基因分型鑒定為基礎，與具有商業價值相關性狀的SNP位點關聯作為依據，利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物，直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

使用傳統方法，具有用時長、成本高、通量低、DNA模板的組成或二級結構有時引起DNA聚合酶不正常終止等缺點。

發明內容

本發明為克服傳統sanger測序法操作較為繁瑣，用時長等缺點，提供了一種鑒別呼倫貝爾短尾羊純合雜合子的PCR-RFLP方法及引物，相較于原來的技術，基于限制性內切酶結果的條帶數量分析，具有極高的敏感性，可以檢測出呼倫貝爾短尾羊T/Brachyury基因c.G334T突變純合子、雜合子的個體差異，并且成本低、通量高、速度快、結果準確、不受實驗環境的局限。

本發明的目的通過以下技術方案實現的：

一種鑒別呼倫貝爾短尾羊純雜合個體PCR-RFLP法所用引物，其特征在于：所述引物序列如下：

BrachyuryFX-F:5’-TGCGCCCCTTCCTTTTCAG-3’

BrachyuryFX-R:5’-GGGGGAGTCGGGGTGGATGTAG-3’。

一種鑒別呼倫貝爾短尾羊純雜合個體的PCR-RFLP方法，其特征在于：其操作步驟為：

步驟1)以樣本基因組DNA為模板擴增Brachyury/T基因的區間序列得到擴增基因片段，所用引物為權利要求1所述序列引物；

步驟2)使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒或PCR產物回收試劑盒對步驟1)所得擴增產物進行回收純化；

步驟3)對步驟2)所得純化產物進行酶切；

步驟4)將步驟3)所得酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳并觀察結果。

所述步驟1)擴增基因片段長度為203bp，PCR反應條件為：95℃3min；95℃15s，65℃15s，72℃12s，共30個循環，72℃5min。