[發(fā)明專利]鑒別呼倫貝爾短尾羊純合雜合子的PCR-RFLP方法及引物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110356310.7
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN112899375A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹貴方;楊光;宋永利;竇傲蕾;馬騰;智達夫;蘇紅;劉默凝;楊宏新;霍雨佳;李喜和;何亭漪;楊燕燕;達來;李秀男
• 申請（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/683;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 趙敬

1.一種鑒別呼倫貝爾短尾羊純雜合個體PCR-RFLP法所用引物，其特征在于：所述引物序列如下：

BrachyuryFX-F:5’-TGCGCCCCTTCCTTTTCAG-3’

BrachyuryFX-R:5’-GGGGGAGTCGGGGTGGATGTAG-3’。

2.一種鑒別呼倫貝爾短尾羊純雜合個體的PCR-RFLP方法，其特征在于：

其操作步驟為：

步驟1)以樣本基因組DNA為模板擴增Brachyury/T基因的區(qū)間序列得到擴增基因片段，所用引物為權(quán)利要求1所述序列引物；

步驟2)使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒或PCR產(chǎn)物回收試劑盒對步驟1)所得擴增產(chǎn)物進行回收純化；

步驟3)對步驟2)所得純化產(chǎn)物進行酶切；

步驟4)將步驟3)所得酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并觀察結(jié)果。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述鑒別呼倫貝爾短尾羊純雜合個體的PCR-RFLP方法，其特征在于：所述步驟1)擴增基因片段長度為203bp，PCR反應(yīng)條件為：95℃3min；95℃15s，65℃15s，72℃12s，共30個循環(huán)，72℃5min。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述鑒別呼倫貝爾短尾羊純雜合個體的PCR-RFLP方法，其特征在于：所述步驟3)使用BciT130 I進行酶切，酶切體系為：步驟2)所得純化產(chǎn)物1μg、Bci T130 I1μl、10X K Buffer 2μl、無菌水補齊體系至20μl，酶切溫度為37℃，反應(yīng)時間為1-1.5小時，酶切完成后，將酶切產(chǎn)物迅速置于冰上冷卻。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述鑒別呼倫貝爾短尾羊純雜合個體的PCR-RFLP方法，其特征在于：所述酶切的反應(yīng)時間為1.5小時。

6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項所述鑒別呼倫貝爾短尾羊純雜合個體的PCR-RFLP方法，其特征在于：所述步驟4)中瓊脂濃度為1％-1.5％。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述鑒別呼倫貝爾短尾羊純雜合個體的PCR-RFLP方法，其特征在于：所述引物BrachyuryFX-F、BrachyuryFX-R為Page純化，工作濃度為10μM。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述鑒別呼倫貝爾短尾羊純雜合個體的PCR-RFLP方法，其特征在于：所述引物工作濃度為10ng/μl。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述鑒別呼倫貝爾短尾羊純雜合個體的PCR-RFLP方法，其特征在于：所述樣本基因組DNA的濃度為80-120ng/μl。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述鑒別呼倫貝爾短尾羊純雜合個體的PCR-RFLP方法，其特征在于：所述樣本基因組DNA的濃度應(yīng)為100ng/μl。