[發明專利]一種免疫磁性表面增強拉曼基底檢測絲素蛋白的方法

有效

• 申請號: 202110355006.0
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113030488B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 王秉;周杰;李青青;彭志勤;萬軍民
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/543;G01N33/552;G01N33/553;G01N33/577;G01N21/65
• 代理公司: 浙江永航聯科專利代理有限公司 33304
• 代理人: 蔡鼎

1.一種免疫磁性表面增強拉曼基底檢測絲素蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）稱取5-6g FeCl₃·6H₂O和2-4gFeSO₄·7H₂O溶解在蒸餾水中，將溶液倒入容器中，在充氮氣的條件下攪拌至溶解；加入3-5gNaOH，70-90℃水浴持續攪拌0.5-1.5h制得Fe₃O₄磁性納米顆粒；

2）稱取200 mg Fe₃O₄于容器中，加入15-20mL濃硝酸，超聲10-30 min，隨后水洗，加入15-25 mL無水乙醇，35-45mL去離子水及 3-5 mL氨水超聲10-30min后取出，攪拌下緩慢滴加3-4mL TEOS，持續攪拌3-5h，隨后乙醇洗，水洗，轉移到比色皿中， 55-65℃條件下真空干燥1-3h得到Fe₃O₄@SiO₂納米顆粒；

3）取150-200 mL去離子水于容器中，加入8-12 mL 1.5-2.5%HAuCl₄，在400-800 r/min，120-140℃條件下攪拌20-30 min，隨后加入8-12 mL、40-60mg/mL檸檬酸鈉水溶液，在120-140℃條件下繼續攪拌 20min，然后停止加熱，繼續攪拌至Au 溶膠為室溫；

4）量取30-50 mg Fe₃O₄@SiO₂于容器內，倒入50-100mL無水乙醇超聲清洗 1-10min，重復，再水洗，隨后加入30-50 mL 2-4%的聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液，35-45℃搖晃溶液至溶解，攪拌 15-25 min，水洗4-8次，得到聚二烯丙基二甲基氯化銨修飾的 Fe₃O₄@SiO₂；

5）超聲條件下向150-250 mL步驟3）所得 Au 溶膠中迅速加入聚二烯丙基二甲基氯化銨修飾的 Fe₃O₄@SiO₂，搖晃條件下將含溶液的容器放入搖床內，常溫搖晃 20-30min，水洗，得到Fe₃O₄@SiO₂-Au；

6）稱量 0.8-1.2gFe₃O₄@SiO₂-Au放入含有 80-120mL無水乙醇的容器中，超聲分散，待固體完全分散后加熱至60-80℃，緩慢內滴加25-35ml 的APTEs，在N₂條件下回流4-8h；反應結束后離心得到固體，用無水乙醇洗滌后真空干燥得（H₂N-）Fe₃O₄@SiO₂-Au；

7）取450-550mg（H₂N-）Fe₃O₄@SiO₂-Au，加入到100mL PBS緩沖液中，超聲分散；加入180-220mL、20-30%的戊二醛溶液，在30-40℃的振蕩水浴鍋中振蕩反應2-3小時；磁性分離固液相，用PBS清洗3-5遍，之后將活化所得磁珠分散在40-60mL PBS緩沖液中，得到8-12mg/mL的活化的（H2N-）Fe₃O₄@SiO₂-Au；

8）取25-35mL上述的活化的（H₂N-）Fe₃O₄@SiO₂-Au，向其中加入含有20-55mg絲素蛋白單克隆抗體的BSA溶液，在30-40℃下振蕩反應1-3h；

9）取絲素蛋白溶解在CB溶液中，加入步驟8）中結合抗體的（H₂N-）Fe₃O₄@SiO₂-Au，在30-40℃條件下震蕩孵育1-3h；

10）混合均勻后滴在硅片上測試拉曼。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1）中，2價Fe與3價Fe的摩爾比為1：1.5-2，反應溶液為100mL。