[發(fā)明專利]一種釀酒酵母表達(dá)人rKGF-1-HSA融合蛋白及其標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110355001.8 | 申請日： | 2021-04-01 |
| 公開（公告）號： | CN113087808A | 公開（公告）日： | 2021-07-09 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 趙俊;許高濤;劉潔;丁爽;周煒;劉家爐;吳蕾 | 申請（專利權(quán)）人： | 蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司;安徽普若汀生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C07K19/00 | 分類號： | C07K19/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/18;C12N15/62;C12N15/81 |
| 代理公司： | 北京科家知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11427 | 代理人： | 王萍 |
| 地址： | 241000 安徽省蕪湖市鳩江區(qū)中國(安徽)自由*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 釀酒 酵母 表達(dá) rkgf hsa 融合 蛋白 及其 標(biāo)準(zhǔn) 制備 方法 | ||
1.一種釀酒酵母表達(dá)人rKGF-1-HSA融合蛋白制備方法，其特征在于，包含以下步驟：
(1)釀酒酵母分泌表達(dá)載體pYES2/CT-Mfα-rKGF-1-HSA的構(gòu)建，具體包括：
設(shè)計(jì)并獲得KGF-1-HSA基因序列和融合蛋白rKGF-1-HSA的氨基酸序列；
根據(jù)rKGF-1-HSA核苷酸序列設(shè)計(jì)并擴(kuò)增目的基因，回收并雙酶切PCR產(chǎn)物和pYES2/CT-MFα質(zhì)粒，用T4 DAN連接酶連接，轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)，獲得陽性克隆pYES2/CT-Mfα-rKGF-1-HSA；
(2)rKGF-1-HSA融合蛋白工程菌的制備、轉(zhuǎn)化，具體包括：
釀酒酵母表達(dá)體系常用溶液及培養(yǎng)基的配制；
將步驟(1)獲得的pYES2/CT-Mfα-rKGF-1-HSA電轉(zhuǎn)化至釀酒酵母INVSc1感受態(tài)細(xì)胞，通過培養(yǎng)基的培養(yǎng)及PCR擴(kuò)增、篩選，獲得陽性克隆子INVSc1/pYES2/CT-Mfα-rKGF-1-HSA；
(3)INVSc1/pYES2/CT-Mfα-rKGF-1-HSA工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)和純化，具體包括：
將步驟(2)獲得的陽性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-rKGF-1-HSA，通過培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)，再依次經(jīng)過金屬離子親和層析和陰離子交換層析純化，即得本發(fā)明獲得的釀酒酵母表達(dá)人rKGF-1-HSA融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種釀酒酵母表達(dá)人rKGF-1-HSA融合蛋白制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，設(shè)計(jì)并獲得KGF-1-HSA基因序列和融合蛋白rKGF-1-HSA的氨基酸序列，具體步驟為：
根據(jù)pYES2/CT-MFα載體的性質(zhì)和釀酒酵母宿主密碼子偏愛性，設(shè)計(jì)了人rKGF-1-HSA基因序列和人rKGF-1-HSA的氨基酸序列，人rKGF-1-HSA基因序列如序列表1所示，人rKGF-1-HSA的氨基酸序列如序列表2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種釀酒酵母表達(dá)人rKGF-1-HSA融合蛋白制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，根據(jù)rKGF-1-HSA核苷酸序列設(shè)計(jì)并擴(kuò)增目的基因，回收并雙酶切PCR產(chǎn)物和pYES2/CT-MFα質(zhì)粒，用T4 DAN連接酶連接，轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)，獲得陽性克隆pYES2/CT-Mfα-rKGF-1-HSA，具體步驟為：
根據(jù)rKGF-1-HSA核苷酸序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，其中：
正向引物：5'ATAAGAAGCGGCCGCAATGAGCTATGA 3'；
反向引物：5'CTAGTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTG 3'；
進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
配制1％瓊脂糖凝膠，電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，紫外燈下快速切下目的條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
提取DH5α/pYES2/CT-MFα中的pYES2/CT-MFα質(zhì)粒；
將質(zhì)粒pYES2/CT-MFα和回收的PCR產(chǎn)物分別用Not I和Xba I進(jìn)行雙酶切，并膠回收雙酶切的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pYES2/CT-MFα；
將雙酶切回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pYES2/CT-MFα質(zhì)粒用T4 DNA連接酶在37℃中連接約30min；
將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)Amp抗性篩選后挑取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培養(yǎng)，獲得陽性克隆pYES2/CT-Mfα-rKGF-1-HSA。
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司;安徽普若汀生物科技有限公司，未經(jīng)蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司;安徽普若汀生物科技有限公司許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/202110355001.8/1.html，轉(zhuǎn)載請聲明來源鉆瓜專利網(wǎng)。
- RNAi轉(zhuǎn)染子的改良選擇方法
- 雙控雙調(diào)節(jié)原核表達(dá)載體系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和用途
- 表達(dá)載體組織、新的生產(chǎn)用細(xì)胞產(chǎn)生方法及其在重組產(chǎn)生多肽中的用途
- 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人淀粉樣Aeta蛋白及純化的方法
- 一種智能表達(dá)式解析平臺(tái)及方法
- 一種復(fù)合表達(dá)式解析方法及系統(tǒng)
- 一種制備N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶的方法
- 定制生成表達(dá)式方法及裝置
- 文本的表達(dá)方法、裝置、電子設(shè)備及可讀存儲(chǔ)介質(zhì)
- 基因表達(dá)調(diào)節(jié)DNA，表達(dá)盒，表達(dá)載體
