[發(fā)明專利]一種釀酒酵母表達(dá)人rKGF-1-HSA融合蛋白及其標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110355001.8
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113087808A
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙俊;許高濤;劉潔;丁爽;周煒;劉家爐;吳蕾
• 申請（專利權(quán)）人: 蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司;安徽普若汀生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/18;C12N15/62;C12N15/81
• 代理公司: 北京科家知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11427
• 代理人: 王萍

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種釀酒酵母表達(dá)人rKGF?1?HSA融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：(1)釀酒酵母分泌表達(dá)載體pYES2/CT?Mfα?rKGF?1?HSA的構(gòu)建；(2)rKGF?1?HSA融合蛋白工程菌的制備、轉(zhuǎn)化；(3)INVSc1/pYES2/CT?Mfα?rKGF?1?HSA工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)和純化。同時(shí)還提供了一種釀酒酵母表達(dá)長效重組人rKGF?1?HSA融合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。本發(fā)明利用釀酒酵母表達(dá)人KGF?1與HSA融合而成的重組蛋白(rKGF?1?HSA)，生產(chǎn)工藝簡單、成本低、產(chǎn)物均一。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種釀酒酵母表達(dá)人rKGF-1-HSA融合蛋白及其標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法。

背景技術(shù)

角質(zhì)細(xì)胞生長因子-1(keratinocyte growth factor-1,KGF-1)，最早由R ubin等發(fā)現(xiàn)存在于胚胎肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)上清中，是成纖維細(xì)胞生長因子(f ibroblastgrowth factors,FGFs)家族的成員之一，又被稱為FGF-7。人KG F-1分子量為26-28kDa，分子量的差異是由多肽鏈結(jié)合的糖蛋白不同引起的。人KGF-1的cDNA編碼的是1條194個氨基酸(前31個氨基酸編碼信號肽)的單鏈多肽。研究發(fā)現(xiàn)在上皮細(xì)胞膜上存在其特異性受體FGFR，在間質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生的KGF-1通過旁分泌途徑與其結(jié)合，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖與分化。KGF-1的生物學(xué)作用主要有促進(jìn)有絲分裂、促進(jìn)細(xì)胞遷移、調(diào)控細(xì)胞分化、抗凋亡和細(xì)胞保護(hù)等作用。

目前KGF-1的獲得主要通過兩條途徑：一是從生物的組織細(xì)胞中提??；二是運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體，利用宿主表達(dá)重組KGF-1。天然提純KGF-1工藝復(fù)雜、成本高，其推廣應(yīng)用受到了限制。而利用基因工程技術(shù)表達(dá)外源基因已成為獲取目的蛋白的高效途徑之一，根據(jù)表達(dá)載體和宿主菌的不同，主要分為原核表達(dá)和真核表達(dá)。原核表達(dá)系統(tǒng)雖成本低廉，但該系統(tǒng)存在容易形成包涵體、獲得的蛋白生物學(xué)活性較低等缺陷，而利用真核表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)Φ鞍走M(jìn)行翻譯后修飾，往往能獲得較高生物學(xué)活性的目的蛋白。

人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是人體血液中的主要蛋白，由585個氨基酸構(gòu)成，是人體循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的含量最多的可溶性蛋白，在血液中的濃度為34～54g/L。HSA由肝臟合成，血清半衰期長，可達(dá)19天。HSA在調(diào)節(jié)血液滲透壓、營養(yǎng)和促進(jìn)傷口愈合等方面發(fā)揮重要作用，廣泛用于肝硬化腹水、燒傷、休克等臨床治療。此外，HSA具有無免疫原性、人體相容性好、組織分布廣和無酶活等特性，使其成為非常理想的重組蛋白融合載體。通過構(gòu)建融合蛋白技術(shù)能夠增加重組蛋白的分子量從而延長半衰期，有效的提高重組蛋白的穩(wěn)定性。

對于生物制品來說，其質(zhì)量評價(jià)的有效性指標(biāo)多采用生物學(xué)方法，這些方法本身變異性較大。因此，標(biāo)準(zhǔn)品是生產(chǎn)中必不可少的組成部分，在生物制品標(biāo)準(zhǔn)化、質(zhì)量控制和效力評價(jià)中，標(biāo)準(zhǔn)品是藥品質(zhì)量評價(jià)的標(biāo)尺，起著非常重要的作用。天然提純KGF-1工藝復(fù)雜、成本高，其推廣應(yīng)用受到了限制。而利用基因工程技術(shù)表達(dá)外源基因已成為獲取目的蛋白的高效途徑之一，根據(jù)表達(dá)載體和宿主菌的不同，主要分為原核表達(dá)和真核表達(dá)。原核表達(dá)系統(tǒng)雖成本低廉，但該系統(tǒng)存在容易形成包涵體、獲得的蛋白生物學(xué)活性較低等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

為克服背景技術(shù)中的技術(shù)問題，本公司利用釀酒酵母表達(dá)的重組人KGF-1與HSA融合而成的重組蛋白(rKGF-1-HSA)，生產(chǎn)工藝簡單、成本低、產(chǎn)物均一，建立了一種經(jīng)濟(jì)、高效、穩(wěn)定表達(dá)的高濃度、高活性的長效重組人KGF-1標(biāo)準(zhǔn)品蛋白，為建立長效人KGF-1蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

一種釀酒酵母表達(dá)人rKGF-1-HSA融合蛋白制備方法，包含以下步驟：

(1)釀酒酵母分泌表達(dá)載體pYES2/CT-Mfα-rKGF-1-HSA的構(gòu)建，具體包括：

設(shè)計(jì)并獲得KGF-1-HSA基因序列和融合蛋白rKGF-1-HSA的氨基酸序列；