[發明專利]一種釀酒酵母表達重組豬硫氧還蛋白的制備方法及其在養殖業中的應用

有效

• 申請號: 202110354990.9
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113106077B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 趙俊;許高濤;徐文俊;王夢;何志遠;孔國慶;蔣敏之
• 申請（專利權）人: 蕪湖英特菲爾生物制品產業研究院有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 王萍

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種釀酒酵母表達重組豬硫氧還蛋白的制備方法，包括以下步驟：(1)釀酒酵母分泌表達載體pYES2/CT?Mfɑ?rPoTRX?His的構建；(2)pYES2/CT?Mfɑ?rPoTRX?His工程菌的制備、轉化；(3)含有pYES2/CT?Mfɑ?rPoTRX?His的釀酒酵母工程菌的搖瓶培養、誘導表達純化及檢定。本發明制備工程菌中PoTRX基因具有釀酒酵母偏愛型特點，并含有釀酒酵母信號肽，可使PoTRX分泌表達，并且大大提高了表達產物的產量，相比大腸桿菌表達系統和其他有益菌分泌表達系統而言，獲取工藝簡單，成本更低。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種釀酒酵母表達重組豬硫氧還蛋白的制備方法。

背景技術

硫氧還蛋白(Thioredoxin,TRX)是一類高度保守的低分子量蛋白質，在細胞內可溶性、對熱穩定、具有氧化還原活性的酸性小分子蛋白質，分子量約為12kDa。TRX廣泛分布于植物、細菌、酵母和動物中，它與硫氧還蛋白還原酶(TR)、還原型煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)三者共同組成硫氧還蛋白系統(TRX系統)，是一個有效的蛋白還原系統。TRX在其保守的活化區域內含有二硫巰基和二硫鍵，其氧化還原活性使硫氧還蛋白具有維持體內穩定的氧化還原狀態、調節細胞生長、抑制凋亡、調節基因轉錄影響蛋白在動物體內的含量、免疫調節等功能。

根據相關文獻報道，豬硫氧還蛋白的獲取方式主要有動物體內誘導和原核誘導表達的方式。2011年，向衛軍將豬硫氧還蛋白與IFNα利用原核誘導表達系統進行可溶性融合表達，并且融合蛋白具有抗豬圓環病毒活性，而融合伴侶TRX蛋白的輔助功能機制尚不清楚。利用基因工程技術表達外源基因可低成本獲取生物活性良好的目的蛋白。根據表達載體和宿主菌的不同，可以通過原核表達和真核表達兩種方法獲取豬硫氧還蛋白。豬硫氧還蛋白原核表達系統雖成本低廉，但該系統存在容易形成包涵體、獲得的蛋白生物學活性較低等缺陷；畢赤酵母中表達需用甲醇誘導，表達產物不能直接用作于飼料，需要提純后才能利用，生產成本高，因此選擇釀酒酵母真核表達系統對豬硫氧還蛋白進行外源表達。

斷奶常誘發仔豬采食量降低生長性能下降以及腹瀉率上升等應激綜合癥。小腸作為機體對營養物質消化、吸收和代謝最主要的器官,以及抵御病原體和致癌物等有害物質的屏障,其發育受阻被認為是導致斷奶應激綜合癥最主要的原因之一。重組豬硫氧還蛋白的添加可以抑制小腸發育受阻進而改善斷奶應激。在日糧添加本發明制備的重組豬硫氧還蛋白對斷奶仔豬腸道蛋白質表達、氧化狀態以及腸細胞增殖和凋亡產生影響,為重組豬硫氧還蛋白作為一種無抗飼料添加劑減緩仔豬斷奶綜合癥機理的研究提供新思路。

發明內容

一種釀酒酵母表達重組豬硫氧還蛋白的制備方法，包含以下步驟：

(1)釀酒酵母分泌表達載體pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的構建，具體包括：

豬硫氧還蛋白基因的人工優化，以獲得質粒pMD19-T-rPoTRX-His；

對質粒pYES2/CT-Mfɑ及以上膠回收的rPoTRX-His片段進行雙酶切，獲得陽性克隆pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His；

(2)pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His工程菌的制備、轉化，具體包括：

釀酒酵母表達體系常用溶液及培養基的配制；

將步驟(1)獲得的pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His以及pYES2/CT-Mfɑ質粒分別轉化釀酒酵母INVSc1感受態細胞，通過培養基的培養及PCR擴增、篩選，獲得陽性克隆子INVSc1(pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His)；

(3)含有pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的釀酒酵母工程菌的搖瓶培養、誘導表達純化及檢定，具體包括：