[發明專利]一種釀酒酵母表達重組豬硫氧還蛋白的制備方法及其在養殖業中的應用

有效

• 申請號: 202110354990.9
• 申請日: 2021-04-01
• 公開（公告）號: CN113106077B
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 趙俊;許高濤;徐文俊;王夢;何志遠;孔國慶;蔣敏之
• 申請（專利權）人: 蕪湖英特菲爾生物制品產業研究院有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 王萍

1.一種釀酒酵母表達重組豬硫氧還蛋白的制備方法，其特征在于，包含以下步驟：

(1)釀酒酵母分泌表達載體pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的構建，具體包括：

豬硫氧還蛋白基因的人工優化，以獲得質粒pMD19-T-rPoTRX-His；

對質粒pYES2/CT-Mfɑ及rPoTRX-His片段進行雙酶切，獲得陽性克隆pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His；

(2)pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His工程菌的制備、轉化，具體包括：

釀酒酵母表達體系常用溶液及培養基的配制；

將步驟(1)獲得的pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His以及pYES2/CT-Mfɑ質粒分別轉化釀酒酵母INVSc1感受態細胞，通過培養基的培養及PCR擴增、篩選，獲得陽性克隆子INVSc1；

(3)含有pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His的釀酒酵母工程菌的搖瓶培養、誘導表達純化及鑒定，具體包括：

將步驟(2)獲得的陽性克隆子INVSc1，通過培養、離心、收集上清液經過柱層析，得純化后的上清蛋白液，經SDS-PAGE電泳以及鼠抗His單克隆抗體經Westernblot鑒定，均可觀察到特異性條帶，即為獲得的釀酒酵母表達重組豬硫氧還蛋白；

所述步驟(1)中，豬硫氧還蛋白基因的人工優化，以獲得質粒pMD19-T-rPoTRX-His，具體步驟為：

根據豬硫氧還蛋白氨基酸序列以及釀酒酵母對密碼子的偏愛性，人工設計了釀酒酵母偏愛型豬硫氧還蛋白基因，豬硫氧還蛋白核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示，豬硫氧還蛋白氨基酸序列為SEQ?ID?N?O.2所示；

將重組豬硫氧還蛋白基因以PoTRX-His的順序插入pMD19-TSi?mpleVector的HindⅢ酶切位點和XbaⅠ酶切位點之間，其5’端Hi?ndⅢ酶切位點，3’端接XbaⅠ酶切位點，由此得到質粒pMD19-T-rP?oTRX-His。

2.根據權利要求1所述的一種釀酒酵母表達重組豬硫氧還蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，對質粒pYES2/CT-Mfɑ及rPoTRX-His片段進行雙酶切，獲得陽性克隆pYES2/CT-Mfɑ-rPoT?RX-His，具體步驟為：

根據rPoTRX-His基因的序列設計合成正向引物rPoTRX-HisF：ATAAGAATGCGGCCGCAATGATGGTTAAGCAAATTGAATC，反向引物rPoTRX-HisR：CTAGTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATAATCAATTCG，通過PCR擴增pMD19-T-rPoTRX-His質粒中rPoTRX-His基因，按照凝膠回收試劑盒說明書進行膠回收；

用QuickCutNotI和QuickCutXbaI分別對購買的質粒pYES2/CT-Mfɑ及以上膠回收的rPoTRX-His片段進行雙酶切，并分別切膠回收rPoTRX-His基因片段和pYES2/CT-Mfɑ片段，然后用T4DNA連接酶進行連接得重組質粒，將重組質粒轉化至大腸桿菌，在含氨芐霉素的LB平板培養基上挑取陽性克隆，經菌液PCR及雙酶切鑒定，選取陽性克隆pYES2/CT-Mfɑ-rPoTRX-His。