[發(fā)明專利]基于RNA-m6A修飾水平的化合物篩選細(xì)胞模型及其構(gòu)建與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110353356.3
• 申請(qǐng)日: 2021-04-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112899238B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周君;劉曉敏;甘銜清;王申
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)藥科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/85;C12N15/113;C12N15/65;C12N15/66;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 競(jìng)存;徐冬濤

1.一種基于RNA-m⁶A修飾水平的化合物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括以下步驟：

（1）構(gòu)建攜帶m⁶A修飾基序的表達(dá)載體：將ADGRE5基因的3’?UTR區(qū)域插入EGFP-C1報(bào)告載體的EGFP序列后的多克隆位點(diǎn)中，獲得攜帶m⁶A修飾基序的表達(dá)載體；

（2）構(gòu)建基于RNA-m⁶A修飾水平的化合物篩選細(xì)胞模型：將（1）構(gòu)建的攜帶m⁶A修飾基序的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，用G418硫酸鹽篩選具有新霉素抗性的細(xì)胞株，再通過(guò)稀釋法獲取篩選模型單克隆細(xì)胞株，所述單克隆細(xì)胞株即基于RNA-m⁶A修飾水平的化合物篩選細(xì)胞模型；

步驟（1）中所述ADGRE5的3’?UTR區(qū)域序列是以HEK-293細(xì)胞的cDNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)，使用特異性引物擴(kuò)增得到的；所述特異性引物為：

hADGRE5-F：5’-?GGAATTCGGCATCAGAGTCCGGCAT-3’，

hADGRE5-R：5’-?CGCGGATCCACAACGTCTACAACCTTCAC-3’；

步驟（1）中所述ADGRE5基因的3’UTR區(qū)域核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2?所示，所述攜帶m⁶A修飾基序的表達(dá)載體的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1?所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟（1）具體操作為：

（1-1）采用EGFP-C1載體序列上的BamH?I和EcoR?I多克隆位點(diǎn)，并用BamH?I和EcoR?I限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增后的ADGRE5基因片段兩端進(jìn)行雙酶切，獲得具BamH?I和EcoR?I粘性末端的ADGRE5基因的3’?UTR片段；

（1-2）用BamH?I和EcoR?I限制性內(nèi)切酶對(duì)EGFP-C1載體進(jìn)行雙酶切，回收EGFP-C1載體酶切產(chǎn)物；

（1-3）連接擴(kuò)增產(chǎn)物和EGFP-C1載體酶切產(chǎn)物，獲得攜帶m6A修飾基序的表達(dá)載體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（2）的具體操作為：

（2-1）轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞：取兩份等量的Opti-MEM培養(yǎng)基，一份與（1）構(gòu)建的攜帶m⁶A修飾基序的表達(dá)載體以5?μg/ml的濃度混合，另一份與Lipofectamine?2000以10?μl?/μl的濃度混合，將兩份混合產(chǎn)物充分混勻，加入貼壁培養(yǎng)HEK-293細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染4小時(shí)，換成體積百分比為10?%的胎牛血清的完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，36-48小時(shí)后觀察細(xì)胞熒光；

（2-2）用G418硫酸鹽進(jìn)行細(xì)胞篩選：在轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞48小時(shí)后加入含800?ng/μlG418硫酸鹽溶液的完全培養(yǎng)基，連續(xù)篩選至細(xì)胞不發(fā)生大量死亡；

（2-3）獲取單克隆細(xì)胞：將（2-2）中的含800?ng/μl?G418硫酸鹽溶液的完全培養(yǎng)基換成含400?ng/μl?G418硫酸鹽溶液的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞株用培養(yǎng)基稀釋并種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)中，確保每孔僅含有1個(gè)細(xì)胞，待培養(yǎng)兩周后，單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)至一團(tuán)細(xì)胞，將具有熒光的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并保存，即為篩選模型的單克隆細(xì)胞株。

4.一種基于RNA-m⁶A修飾水平的化合物篩選細(xì)胞模型，其特征在于，所述基于RNA-m⁶A修飾水平的化合物篩選細(xì)胞模型是通過(guò)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的。

5.權(quán)利要求4所述的基于RNA-m⁶A修飾水平的化合物篩選細(xì)胞模型在篩選影響m⁶A修飾水平的化合物中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，將待篩選化合物與所述細(xì)胞模型混合后，檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度，如細(xì)胞熒光強(qiáng)度有變化，則所述待篩選化合物為對(duì)m⁶A修飾水平有影響的化合物。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括以下步驟：

向細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入DMEM培養(yǎng)基，所述DMEM培養(yǎng)基的加入量為1.5?ml?DMEM培養(yǎng)基/3.5?cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，將所述基于RNA-m⁶A修飾水平的化合物篩選細(xì)胞模型以4×10⁵個(gè)細(xì)胞/3.5?cm細(xì)胞培養(yǎng)皿的比例接種，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到60?%；

向培養(yǎng)基中加入待篩選化合物，所述待篩選化合物的加入量為0.1-1.5?μl/3.5?cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)40小時(shí)；

培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞并使用PBS緩沖液清洗，再加入200?μl?RIPA細(xì)胞裂解液，裂解15分鐘后，加入RIPA裂解液兩倍體積的50?mM?Tris-Hcl，充分混勻，所述50?mM?Tris-Hcl?的pH=10.0；

按照每孔80?μl體積將步驟（3）的混合產(chǎn)物加入到無(wú)蓋的96孔酶標(biāo)板中，采用酶標(biāo)儀對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，通用檢測(cè)波長(zhǎng)為激發(fā)波長(zhǎng)479?nm，發(fā)射波長(zhǎng)520?nm。